細胞調亡的流式細胞儀檢測技術
一、固定細胞的染色方法
1）PI單染色法
方法一
1．收集細胞（1～5）×106個，500～1000r/min離心5min，棄去培養液。
2．3ml PBS洗一次。
3．離心去PBS，加入冰預冷的70％的乙醇固定，4℃，1h。
4．離心棄去固定液，3ml PBS重懸5min。
5．400目的篩網過濾1次，500～1000r/min離心5min，棄去PBS。
6．用1ml PI染液，4℃避光30min。
7．流式細胞儀檢測：PI用氬離子激發熒光，激發光波波長為488nm，發射光波波長大于630nm，產生紅色熒光，可分析前散射光對側散射光的散點圖及PI熒光的直方圖。
方法二
1．收集細胞（1×106個），500～1000r/min離心5min，棄去培養液。
2．1ml PBS/FCS洗一次。
3．500～1000r/min離心5min去PBS/FCS，加入500μl PBS/FCS和500μl的多聚甲醛固定液，輕輕混勻，在4℃下固定4min。
4．500～1000r/min離心5min棄去固定液，室溫加入含0.2％ Tween的PBS 1ml，37℃孵育15min。
5．1ml PBS/FCS洗3次，每次5min。
6．400目的篩網過濾1次。
7．500～1000r/min離心5min去PBS/FCS，用1.0ml PI染液，4℃避光至少30min。染色在24h之內皆可行，流式細胞儀分析。
2）調亡細胞的TUNEL的流式細胞儀分析
1．離心收集細胞，PBS洗1～2次。
2．1％多聚甲醛低溫下固定15min。
3．3ml PBS洗1次，70％乙醇固定，冰箱內放置1～3天。
4．PBS輕洗1次
5．細胞與TdT標記液37℃孵育，時間1～2h。
6．PBS輕洗1次。
7．細胞在黑暗中37℃與100μl的染色緩沖液孵育30min。
8．含0.1％ Triton-X 100的PBS輕洗1次。
9．1ml PBS（含5mg/ml PI, 0.1% RNase A）重懸。
10． 流式細胞儀分析紅色（PI）對綠色熒光（FITC）的地形圖。
3）ISNT的流式細胞儀分析
1．離心收集細胞，PBS洗1～2次
2．1％多聚甲醛低溫下固定15min。
3．3ml PBS洗1次，70％乙醇固定，冰箱內放置1～3天。
4．PBS輕洗1次。
5．2×105細胞與12.5μl的缺口平移緩沖液在15℃共孵育6h，每過15min振動1次。
6．PBS輕洗1次。
7．細胞在黑暗中37℃與100μl的染色緩沖液孵育30min。
8．含0.1％ Triton-X 100的PBS輕洗1次。
9．1ml PBS（含5mg/ml PI, 0.1% RNase A）重懸。
10． 流式細胞儀分析紅色（PI）對綠色熒光（FITC）的地形圖。
二、非固定細胞的染色方法
1）Hoechst 33342/PI雙染色法
1．懸浮生長的細胞在培養狀態下加入Heochst 33342，終濃度為1μg/ml；帖壁生長的細胞用含有0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化成單細胞懸液，離心，棄上清，用1ml全培養液重懸細胞，加入Heochst 33342，終濃度為1μg/ml，37℃孵育7～10min。
2．4℃ 500～1000r/min離心棄去染液。
3．加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。
4．400目的篩網過濾1次。
5．流式細胞儀分析。
2）Annexin V/PI雙染色法
1．細胞收集：懸浮細胞直接收集10ml的離心管中，而帖壁細胞先用滴管輕輕吹打，調亡細胞一經吹打可能脫壁，收集到10ml的離心管中，沒脫壁的細胞用0.02％的EDTA消化使之脫壁，每樣本細胞數為（1～5）×106，500～1000r/min離心5min棄去培養液。
2．用孵育緩沖液洗1次，500～1000r/min離心5min。
3．用100μl的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育10～15min。
4．500～1000r/min離心5min沉淀細胞，孵育緩沖液洗1次。
5．加入熒光溶液4℃下孵育20min，避光并不時振動。