Percoll不連續密度梯度沉淀法分離純化淋巴細胞和淋巴母細胞
| 實驗方法原理 | Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低（<20 mosm/kg H2O）， 粘度也很小，可形成高達1.3 g/ml密度，采用預先形成的密度梯度時可在低離心力（200～1000 g）于數分至數十分鐘內達到滿意的細胞分離結果。由于Percoll擴散常數低，所形成的梯度十分穩定。此外，Percoll不穿透生物膜，對細胞無毒害，因此廣泛用于分離細胞、亞細胞成分、細菌及病毒，還可將受損細胞及其碎片與完好的活細胞分離。 |
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| 實驗材料 | Percoll |
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| 試劑、試劑盒 | PBS血清 |
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| 儀器、耗材 | 試管注射器離心機 |
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| 實驗步驟 | 1. 不同濃度（密度）Percoll溶液的制備
先用9 份Percoll與1 份8.5 ％ NaCl或1.5 MPBS混合達到生理性滲透壓，然后用生理溶液（0.85 ％ NaCl或0.15 M PBS）稀釋到所需濃度。
Percoll濃度（％） 70 60 50 40 30 20
比重（g/ml） 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031
2. 不連續密度梯度Percoll層的制備
先將試管壁用牛血清濕潤，除去多余血清，這種預處理可使逐層疊加的Percoll液平穩沿管壁流下，使形成滿意的界面。在制備過程中一般用長針頭注射器從高密度向低密度逐層放置，有時相鄰兩層Percoll比重相差不大時，可將Percoll液放入注射器中，小針頭斜面緊貼管壁，任其自然慢慢流下。
3. 裝樣
樣品體積和細胞濃度根據不同細胞而異，一般加樣體積不宜過大，細胞濃度也不可過高，否則會影響細胞的分離和回收。
4. 離心
一般采用離心力為400 g，時間20～25 min。由于多層Percoll之間密度差別不大，因此離心機加速、降速時要慢，要平穩。
5. 取樣
當所要分離的細胞絕大部分在兩層的界面時，可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細胞；有時大部分細胞位于Percoll層中，則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細胞經2 次洗滌后可供培養或檢測用。 展開 |
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| 其他 | 一、分離純化細胞舉例
1. 富含NK活性大顆粒淋巴細胞（LGL）的純化
按順序由下向上逐層加50 ％、47.5 ％、45 ％、42.5 ％和40 ％五種不同密度的Percoll，如用10 ml試管（或塑料管）分離，每層Percoll約1.2～1.5 ml，初步從外周血中分離的PBMC細胞1×108懸于1 ml培基中，按要求裝樣、離心和取樣。一般富含NK殺傷活性的LGL細胞位于42.5％與45％Percoll界面以及上下二層的Percoll液中。
2. 純化淋巴母細胞和除去死細胞
分別疊加50 ％和30 ％Percoll液。收取經PHA（或其它抗原、有絲分裂原）刺激PBMC，或含有較高比例異型的PBMC（如腎綜合征出血熱患者），按要求裝樣、離心和取樣。位于管底的淋巴細胞為小淋巴細胞；兩層Fercoll之間為淋巴母細胞，純度和回收率在80％以上，位于30 ％Percoll表面是死細胞。收獲淋巴母細胞可進行表型、結構以及功能的研究。
二、人不同血細胞的漂浮密度
人不同血細胞的漂浮密度
細 胞 漂浮密度
紅細胞 1.09-1.11 粒細胞
嗜酸性 1.09-1.095
嗜中性 1.080-1.085 單核細胞 1.050-1.066
血小板 1.030-1.060
淋巴細胞 1.052-1.077
B淋巴細胞 1.062-1.075 T淋巴細胞 1.065-1.077
淋巴母細胞 1.065-1.077
自然殺傷細胞 1.050-1.070 展 |
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