實驗方法原理 常用來分離人外周血單個核細胞（PBMC）的分層液比重是 1.077±0.001 的 聚 蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺（Urografin）（F/H）分層液。Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，水性高，平均分子量為400000，當密度為1.2 g/ml仍未超出正常生理性滲透壓，也不穿過生物膜。紅細胞、粒細胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細胞，就可從外周血中分離到單個核細胞。
實驗材料 淋巴細胞分離液血清肝素
試劑、試劑盒 肝素Hank's液PBS
儀器、耗材 滴管吸管針頭碘酒酒精棉球止血帶計數板顯微鏡離心機
實驗步驟
1. 在短中管中加入適量淋巴細胞分離液。
2. 取肝素抗凝靜脈血與等量Hank's液或RPMI1640充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000 rpm×20 分鐘。
3. 離心后管內分為三層，上層為血漿和Hank's液，下層主要為紅細胞和粒細胞。中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。此外，還含有血小板。
4. 用毛細血管插到云霧層，吸取單個核細胞。置入另一短中管中，加入5 倍以上體積的Hank's液或RPMI1640，1500 rpm×10 分鐘，洗滌細胞兩次。
5. 末次離心后，棄上清，加入含有10 ％小牛血清的RPMI1640，重懸細胞。取一滴細胞懸液與一滴0.2 ％臺盼蘭染液混合，于血球計數板上，計數四個大方格內的細胞總數。
4個大方格內細胞總數
單個核細胞濃度（細胞數/1 毫升細胞懸液）＝────────×104×2（稀釋倍數）
4
6. 細胞活力檢測
死的細胞可被染成蘭色，活細胞不著色。計數200個淋巴細胞。計算出活細胞百分率。
活細胞數
活細胞百分率＝────── ×100 ％
總細胞數
用本法分離PBMC，純度在90 ％以上，收獲率可達80～90 ％，活細胞百分率在90 ％以上。
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注意事項
1. 抽取人外周靜脈血時要注意無菌操作。
2. 操作全程應盡可能短時間內完成，以免增加死細胞數。
3. 用淋巴細胞分離液分離PBMC時，離心機轉速的增加和減少要均勻、平穩，使保持清晰的界面。
4. 小鼠、兔等動物淋巴細胞比重與人不同，配制相應密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。
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其他
一、附錄
1. Hank's液（無Ca2＋、Mg2＋）配制法
NaCl 8.0 克，KCl 0.4 克，Na2HPO4·12H2O 0.12 克，KH2HPO40.06 克，葡萄糖1.0 克，雙蒸水1000 毫克，1％酚紅液2 毫克
將上列成分混合后溶化，分裝于500 毫升鹽水瓶內，8 磅15 分鐘滅菌，4 ℃冰箱保存，臨用時調PH至7.3～7.6。
2. 細胞分層液配制法
9 ％聚蔗糖24 份，34 ％泛影葡胺10 ％
混合，測比重為1.077～1.078，G5玻璃濾器過濾除菌。4 ℃冰箱保存備用。
3. 磷酸緩沖液（PB）
原液
A液
0.2 M NaH2PO4溶液，NaH2PO4 27.6 克，或NaH2PO4·2H2O 31.2 克，蒸餾水，溶解至1000 毫升
B液
0.2 M Ha2HPO4溶液，Ha2HPO4·12H2O 71.6 克，蒸餾水溶解至1000 毫升
各種不同PH值PB的配法
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PH 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0
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A液（ml） 39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.5
B液（ml） 61.0 72.0 81.0 87.0 91.0 94.5
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舉例
0.1 M PH7.2PB
A液28 毫升，B液72 毫升，加蒸餾水100 ml
4. 血球保存液
葡萄糖2.05 克，枸椽酸鈉0.8 克，氯化鈉0.42 克，蒸餾水100 毫升
將上述成分混勻，略加溫使其溶解，分裝小瓶（100毫升）。經10 磅、10 分鐘高壓滅菌。4 ℃保存備用。
5. 培養液配置
（1）RPMI-1640培養液
RPMT-1640（FLOW公司出品）1 袋，三蒸水1000 毫升，電磁攪拌30 分鐘：1N HCl 調PH7.2～7.4（約加2.5 毫升），過濾除菌，作無菌試驗，4 ℃保存。
（2）不完全RPMI-1640培養液
RPMI-1640 95 毫升，0.1M丙酮酸鈉 1 毫升，0.2 M谷氨酰胺 1 毫升，1 M Hepes 1 毫升，7.5 ％ NaHCO3 1 毫升，青霉素、鏈霉素（各1萬單位）1 毫升
（3）完全RPMI-1640培養液
不完全1640培養液90 毫升，滅活胎牛（或新生牛）血清10 毫升