細胞周期的四種檢測方法詳解（一）

細胞周期指細胞一個世代所經歷的時間。從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。細胞周期是一個重要的檢測參數，研究細胞周期變化的影響對于腫瘤的發展及藥物研發有著重要的作用。例如，已知抑制有絲分裂的化合物大都用來減緩腫瘤細胞的生長。

細胞周期內有兩個階段最為重要：G1 到 S 和 G2 到 M；這兩個階段正處在復雜活躍的分子水平變化的時期，容易受環境條件的影響，如果能夠人為地進行調控，將對深入了解生物的生長發育和控制腫瘤生長等有重要意義。能夠方便有效地檢測細胞周期的變化，對于藥物研發和疾病研究等都具有重要的意義。

單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現多采用其他方法測群體周期。

那么，細胞周期的測定如何進行的呢？測定細胞周期的方法很多，有同位素標記法、流式細胞儀法、基于細胞成像的熒光檢測法等。

一、同位素標記法測定細胞周期

標記有絲分裂百分率法 (PLM) 是一種常用的測定細胞周期時間的方法。其原理是對測定細胞進行脈沖標記、定時取材、利用放射自顯影技術顯示標記細胞，通過統計標記有絲分裂細胞百分數的辦法來測定細胞周期。

測定原理：

① 待測細胞經 3H- 胸腺嘧啶核苷標記后，所有 S 期細胞均被標記。
② S 期細胞經 G2 期才進入 M 期，所以一段時間內 PLM = 0。
③ 開始出現標記 M 期細胞時，表示處于 S 期最后階段的細胞，已渡過 G2 期，所以從 PLM = 0 到出現 PLM 的時間間隔為 G2期的持續時間。
④ S 期細胞逐漸進入 M 期，PLM 上升，到達到最高點的時候說明來自處于 S 最后階段的細胞，已完成 M，進入 G1 期。所以從開始出現 M 到 PLM 達到最高點 (≈ 100%) 的時間間隔就是 M 期的持續時間。
⑤ 當 PLM 開始下降時，表明處于 S 期最初階段的細胞也已進入 M 期，所以出現 LM 到 PLM 又開始下降的一段時間等于 S 期的持續時間。

二、流式細胞儀 PI 染色法

細胞周期分為間期與分裂期兩個階段。間期又分為三期：即 DNA 合成前期 ( G1 期 )、DNA 合成期 ( S 期 ) 與 DNA 合成后期 ( G2 期 )。某些細胞在分裂結束后暫時離開細胞周期，停止細胞分裂，執行一定生物學功能 ( G0 期 )。

檢測細胞周期的原理：

由于細胞周期各時相的 DNA 含量不同，通常正常細胞的 G1 / G0 期具有二倍體細胞的 DNA 含量 ( 2N )，而 G2 / M 期具有四倍體細胞的 DNA 含量 (4N)，而 S 期的 DNA 含量介于二倍體和四倍體之間。PI可以與 DNA 結合，其熒光強度直接反映了細胞內 DNA含量。因此，通過流式細胞儀 PI 染色法對細胞內 DNA 含量進行檢測時，可以將細胞周期各時相區分為 G1 / G0 期，S 期和 G2 / M期，獲得的流式直方圖對應的各細胞周期可通過特殊軟件計算各時相的細胞百分率。

三、基于成像的熒光檢測法

FUCCI (fluorescent ubiquitination-based cell-cycle indicator) 小球能鑒別細胞處在細胞周期的哪一時期，因此可以用來研究癌癥細胞周期的進程。FUCCI 技術建立在鑒定過表達的兩種調節細胞周期的蛋白 geminin 和 Cdt1 水平上，其中 geminin 融合的是綠色熒光基團 AmCyan，而 Cdt1 融合的是紅色熒光基團 mCherry。Cdt1 和 geminin 的水平隨著細胞周期的變化而不斷波動：Cdt1 蛋白水平在 G1 階段達到峰值，而 geminin 蛋白水平在 S，G2 和 M 期不斷升高。這一結果體現為表達 FUCCI 細胞核在G1 期為紅色而在 S，G2 和 M 期則呈現綠色 ( 圖 2 )。

1 檢測方法

A375S FUCCI 球體準備的方法如下：Corning 公司 96 孔 U 型底低吸附細胞培養板中加入含有 EGF (20 ng / mL) 和 B27 (1×)的 DMEM / F 12 培養基，按每孔 1,000 細胞進行種板。細胞板離心 (800 g,6 min) 后在 37 ℃，5% CO₂條件下進行孵育。最后，用含 10% FCS 的培養基清洗球體 3 次以移除 EGF 和 B27，繼續培養 1 至 6 天。