細胞周期測定實驗——BrdU滲入法

細胞周期指細胞一個世代所經歷的時間。從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。

單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現多采用其他方法測群體周期。

BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養基后，可做為細胞DNA復制的原料，經過兩個細胞周期后，細胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應表現為一條單體淺染。如經歷了三個周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細胞如果僅經歷了一個周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就可算出細胞周期的值。

細胞

BrdU甲醇冰醋酸Giemsa染液秋水仙素SSC檸檬酸三鈉NaCl

冰箱玻片水浴鍋鍋蓋紫外燈光學顯微鏡

一、試劑配制

1.  BrdU配制

BrdU 10 mg加雙蒸水10 ml ，4℃下避光保存。

2.  2xSSC配制

NaCl 1.75 g，檸檬酸三鈉0.88 g，加水至100 ml，4℃保存。

二、細胞生長至指數期時，向培養液中加入BrdU，使最終濃度為10 ug/ml。

三、44小時加秋水仙素，使每ml中含0.1 ug。

四、48小時后常規消化細胞至離心管中，注意培養上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。

五、常規染色體制片。

六、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2xSSC 液，距紫外燈管6 cm處紫外照射30分鐘。

七、棄去2xSSC液，流水沖洗。

八、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。

九、鏡檢100個分裂相，計第一、二、三、四細胞期分裂指數。

十、計算

細胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小時）

一、細胞周期介紹

細胞周期（cell cycle)是指細胞從前一次分裂結束起到下一次分裂結束為止的活動過程，分為間期與分裂期兩個階段 。

1.  間期

間期又分為三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。

（1）G1期　　

此期長短因細胞而異。體內大部分細胞在完成上一次分裂后，分化并執行各自功能，此G1期的早期階段特稱G0期。在G1期的晚期階段，細胞開始為下一次分裂合成DNA所需的前體物質、能量和酶類等。

（2）S期　　

S期是細胞周期的關鍵時刻，DNA經過復制而含量增加一倍，使體細胞成為4倍體，每條染色質絲都轉變為由著絲點相連接的兩條染色質絲。與此同時，還合成組蛋白，進行中心粒復制。S期一般需幾個小時。

（3）G2期　　

為分裂期做最后準備。中心粒已復制完畢，形成兩個中心體，還合成RNA和微管蛋白等。G2期比較恒定，需用1～1.5小時。

2.  分裂期

細胞的有絲分裂（mitosis）需經前、中、后，末期，是一個連續變化過程，由一個母細胞分裂成為兩個子細胞。一般需1～2小時。

（1）.前期（prophase）染色質絲高度螺旋化，逐漸形成染色體（chromosome）。染色體短而粗，強嗜堿性。兩個中心體向相反方向移動，在細胞中形成兩極；而后以中心粒隨體為起始點開始合成微管，形成紡錘體。隨著核仁相隨染色質的螺旋化，核仁逐漸消失。核被膜開始瓦解為離散的囊泡狀內質網。

（2）中期（metaphase）細胞變為球形，核仁與核被膜已完全消失。染色體均移到細胞的赤道平面，從紡錘體兩極發出的微管附著于每一個染色體的著絲點上。從中期細胞可分離得到完整的染色體群，共46個,其中44個為常染色體,2個為性染色體。男性的染色體組型為46,XY，女性為46XX。分離的染色體呈短粗棒狀或發夾狀，均由兩個染色單體借狹窄的著絲點連接構成。

（3）后期（anaphase）由于紡錘體微管的活動，著絲點縱裂，每一染色體的兩個染色單體分開，并向相反方向移動，接近各自的中心體，染色單體遂分為兩組。與此同時，細胞波拉長，并由于赤道部細胞膜下方環行微絲束的活動，該部縮窄，細胞遂呈啞鈴形。

（4）末期（telophase）染色單體逐漸解螺旋，重新出現染色質絲與核仁；內質網囊泡組合為核被膜；組胞赤道部縮窄加深，最后完全分裂為兩個2倍體的子細胞。

在體內根據細胞的分裂能力可把它們分為三類：

①增殖細胞群，如造血干細胞，表皮與胃腸粘膜上皮的干細胞。這類細胞始終保持活躍的分裂能力，連續進入細胞周期循環。

②不再增殖細胞群，如成熟的紅細胞、神經細胞、心肌細胞等高度分化的細胞，它們喪失了分裂能力，又稱終末細胞（end cell）。

③暫不增殖細胞群，如肝細胞、腎小管上皮細胞、甲狀腺濾泡上皮細胞。它們是分化的，并執行特定功能的細胞，在通常情況下處于G0期，故又稱G0期細胞。在某種刺激下，這些細胞重新進入細胞周期。如肝部分切除術后，剩余的肝細胞迅速分裂。