3 生物性污染的來源、危害及預防 外界的微生物如昆蟲、節肢動物、原蟲、霉菌、病毒、細菌、無細胞壁的微生物(通常指支原體)和其它類型的細胞都可能侵入培養環境引起污染。只要在一個開放的環境中進行培養，都難以避免發生污染。發生污染的可能性取決于操作方法、培養室的無菌環境以及實驗室的規章制度。生物性污染對細胞代謝的影響，可因污染源和細胞的種類不同而表現各異。細菌、真菌或其它微生物污染的檢測可以用不同培養基進行檢查。支原體污染的檢測需要特殊的方法。病毒污染的檢測可以使用許多體內或體外實驗，包括大鼠或小鼠的接種、逆轉錄酶分析、凝血試驗、紅細胞吸附試驗等。
細菌和真菌的污染較易發現并及時清除，而大多數實驗室對支原體的污染缺乏足夠的認識。為了防止支原體及其它微生物污染的發生和傳播，必須建立規范的無菌操作程序及各種規章制度。支原體歸屬于柔膜體綱(Mollicutes)的支原體目，它們都具有以下共性:無細胞壁、無細胞壁主要成分———粘肽的表達。支原體與其它細菌不同之處還在于其胞膜中含有膽固醇或其它甾醇，這種特性使支原體膜更具柔順性，對于物理因素，如壓力、滲透壓、脫水的抵抗力很3大。支原體直徑僅有013～018μm，并且變形能力大，故能通過濾菌器。需要指出的是，只要有一個具有增殖能力的支原體就能引起培養體系的污染。一旦細胞被污染，支原體的滴度隨著時間的延長而逐漸升高，最高可至每毫升10克隆。最為致命的是，即使存在很嚴重的支原體污染，細胞外觀可無明顯變化。如果繼續使用這種已被支原體污染，而貌似正常的細胞做實驗，將會嚴重影響實驗結果。
3.1來源 培養體系中支原體污染的最可能途徑是經已被支原體污染的細胞擴散和傳播。細胞被支原體污染后，支原體可以與宿主細胞形成一個共生體系，使污染不斷擴大。一旦發生支原體污染，支原體和其它微生物會隨著飛沫而不斷傳播。操作過程中移液，傾倒液體時都會產生具有潛在感染能力的飛沫，并沉積在接觸到的表面。這種污染性飛沫能存活數天甚至數星期。此外，操作失誤引起的交叉污染也是支原體污染的一個常見途徑。人體的組織及體液成分是細胞培養中支原體污染的主要來源。污染的細胞中通常能分離到人類口腔支原體、發酵支原體、唾液支原體以及其它一些與人有關的支原體，如 M.buccale，M.faucium，M.homo2nis，M.pirum和生殖支原體等。無菌操作過程中，操作者能產生有污染性的隨空氣傳播的飛沫和微粒，造成培養體系的污染。人體外周血、骨髓、淋巴組織原代培養中有可能發生發酵支原體的原發污染(primarycontamination)，這也證明支原體在分化細胞中較未分化細胞更易生長。隨著培養技術的不斷發展，人們已能培養來自不同物種如動物、植物、昆蟲的各種細胞，同時也擴大了支原體及其它微生物的宿主范圍。此外，某些支原體，如菜氏無膽甾原體科(Acholeplasmalaidlawii)、M.arginini、 M.hyorhinis、口腔支原體、唾液支原體能寄生不同的宿主，并能在培養體系中穩定增殖數年。牛血清中能分離到A.laidlawii、 M.arginini和M.hyorhinis支原體，因此血清可能成為支原體污染的來源。由于無血清培養基中許多附加成分及試劑是從血清或其它生物制品中制備的，因此無血清培養體系并不能排除支原體污染的危險。盡管隨著培養技術的進步，血清發生污染的可能性進一步降低，但只要有一個活的支原體能通過濾菌器，整個培養體系就會被污染。
3.2 危害 支原體通過產生代謝產物及消耗各種養分，如核酸前體及必需氨基酸，從而改變細胞的代謝狀態。支原體可以酵解糖，分解精氨酸，氧化丙酮酸，解脲支原體可以利用尿素作為能源，這會使細胞代謝發生一系列改變，從而影響蛋白質、DAN、RNA合成以及嘌呤從頭合成及補償合成途徑。污染時間的長短及核酸代謝改變決定了支原體污染造成的危害程度，導致細胞染色體斷裂、重排、非整倍體的出現。隨后，細胞的生長特性發生改變，使某些酶和細胞因子的產生增加，并表現出一些特殊的細胞功能，而其它一些細胞正常的功能則被抑制。某些支原體附著在細胞表面后，會與宿主細胞交換膜抗原成分。隨著細胞膜成分的改變，細胞的形態及抗原性發生改變。細胞污染對研究工作帶來的最大危害是由于錯誤的實驗結果導致研究誤入歧途。此外，支原體污染還會干擾細胞的篩選，如雜交瘤細胞生長受到抑制并喪失產生單抗的能力。
3.3 預防及控制 污染發生后首先應確定污染物的種類及污染的程度。為了能正確檢測細菌或支原體的污染，應先撤去培養液中的抗生素。常規細胞傳代培養中應用抗生素會導致:①掩蓋了不很嚴重的污染;②導致了耐藥菌的產生。每一種抗生素的抗菌譜都是有限的，而且許多抗生素僅是抑制細菌生長，而非殺菌劑。因為支原體無細胞壁，所以青霉素，頭孢菌素等干擾細胞壁合成的抗生素對于支原體無效。菌檢及支原體檢測只有在撤去抗生素后才能進行。實驗中若發生污染或其它問題應有詳細的記錄，并由經驗豐富的專家分析，找出哪個環節出了問題，包括培養液的配置、實驗室環境的保持和無菌操作過程等，從而不斷完善操作規程，避免類似問題的現。此外，管理者還應制定細胞培養的各項規章制度，教育每一個實驗人員遵守。實驗室負責人應根據情況，制定修改各項規范的操作程序及人員培訓計劃。一般來說，隨著實驗室規模的擴大，細胞發生變異和污染的可能性增加了。因此，大型實驗室應嚴格制定各項操作程序及規章制度。細胞培養中無菌操作需要清潔的工作環境、實驗的合理安排、實驗者熟練的操作技巧及強烈的責任感。只有通過不斷地學習、訓練，才能熟練掌握無菌操作技術。為了盡可能減少污染的發生，以常規檢查的方式來監督是必要的。細胞培養中發生污染是不可避免的，我們的目的是盡可能減少污染的發生及危害。
根據美國實驗室的調查報告顯示，至少10%的細胞系存在支原體的污染。一旦發生污染，如果細胞有詳細的記錄，則污染引起的危害較小。我們可以根據細胞定期菌檢記錄拼棄最后一次細胞菌檢陰，性后的實驗結果。利用菌檢陰性的細胞重新開始實驗。如果僅偶爾進行菌檢或采用非特異檢測方法，尤其是支原體污染，那么確定污染的范圍比較困難。因為所有的細胞系都有可能被交叉污染。一旦發生污染，所有未進行菌檢的凍存細胞都必須進行菌檢，以去除污染的細胞并明確污染發生的時間。
3.4 檢測 由于支原體污染并不引起細胞外觀的明顯變化，故常規的支原體檢測非常必要的。人們可利用一系列直接或間接的方法檢測支原體。但由于支原體種類的多樣性，目前還沒有一種方便、廣譜、特異性高、準確的檢測方法。因此，有必要對不同檢測方法的靈敏度及局限性有所了解。
不同檢測方法對送檢標本的要求不同，如果標本不合格，將不可能獲得正確的結果。血清、培養液或培養基附加成分在加工和儲存過程中污染會在一6定程度上被稀釋，影響檢出率。間接檢測法由于其敏感性較差，若不采用濃縮標本，則不適用于檢測血清和培養液的污染。由于污染物的隨機分布，因此僅進行一次檢測通常會出現假陰性。如果標本中污染物濃度低于10個污染物/ml，隨機抽取1ml標本進行檢測可能有366%的假陰性率。增加1標本體積，濃縮標本有助于降低假陰性率。另一種假陰性的產生是由于污染物在試劑瓶，凍存瓶等容器中的分布不均所致。若20個樣品中有一個被污染(5%的污染率)，檢測所有20個樣品，假陰率為。需要指出的是僅僅單次檢測一個標本來3616%，判斷有無生物性污染的作法是不可靠的。因此，在分裝液體前，就應當從原液中盡可能多取一點液體進行檢測。如果不能做到這一點，則應該用標準方法選擇多個標本進行檢測。例如，在無菌過濾操作中，隨著濾過體積的增大，濾膜破損的可能性增加，故應選擇最后過濾的液體進行檢測。
標本的處理與標本的選擇同樣重要。各種酶如胰酶、脂酶，強酸，強堿或其它化學物質會破壞支原體膜的脂質，使支原體喪失活力及膜的完整性。膜的完整性被破壞后，支原體內的蛋白酶及核酶釋放，從而會干擾間接檢測方法的結果。如果標本收集后不能當天檢測，則應該盡快凍存標本以防止降解。
選擇、處理檢測標本的目的是盡可能發現潛在的污染。在細胞培養過程中就應考慮到支原體污染的檢測。我們最好選用無抗生素培養，檢測應盡可能離傳代時間長一點，以便讓任何潛在的污染物生長、繁殖。為防止支原體活力喪失，如果檢測的是貼壁細胞，應采用刮除細胞的方法，因為胰酶或其它生化分離方法會降低支原體的活性。在選用合適的檢測方法時，應考慮到支原體的滴度和活力這兩個因素。直接培養法是最敏感的，但也是最耗時的檢測方法，大約需28天。從理論上講，只需一個有活力的支原體就能在培養基上生長。但某些難以培養的支原體限制了直接培養法的應用。理想的直接培養法應采用多功能的培養基，以降低假陰7性率。為增加對低滴度和低活力支原體檢出率，應采用有氧和無氧兩種培養條件及幾種傳代方式。直接培養法還需要活性支原體作為陽性對照，而且耗時，操作繁瑣，因而不適于大多數實驗室。檢測支原體污染的間接法包括CR、 ELISA、電子顯微鏡檢查、DNA探針、DNA熒光染色及生化7分析法等。間接法能檢測到10/L的滴度。通常情況下，支原體污染后其滴度一般超過 10/L，故盡管間接法不敏感，但相對較精確。由于支原體的多樣，表達不同特異性的抗原及酶，為生化及免疫檢測8法帶來技術上的困難。在選擇PCR、 DNA探針等方法前，應考慮好選擇合適的靶序列及引物序列。DNA熒光染色法和直接培養法相結合是支原5體檢測的金標準。美國、加拿大、日本和歐共體國家生物制藥及診斷的監督機構推薦使用這種方法。其基本原理在于利用不同的技術，多次檢測，以彌補各種檢測技術的缺陷，增加檢測結果的可信度。
3.5 控制及排除 控制支原體污染或其它生物性污染的唯一可靠的方法是所有可能污染的物品用高壓蒸氣滅菌法消毒。所有細胞培養設備都應消毒，應嚴格遵守上述的各項規章制度及監督制度，直至所有潛在的污染源都被消除。細胞一旦被支原體污染，要將它清除是非常困難的。由于一些不可復得的細胞被污染，人們不得不設法清除污染，挽救一些珍貴的細胞。事實上，經支原體污染的細胞，在污染經處理被清除后，細胞原有的許多生物學特性，如基因的表達，抗原性和代謝特點也隨之發生了相應的改變。排除支原體污染的方法，包括使用抗生素、抗血清、裸鼠體內接種、巨噬細胞吞噬、胰酶消化等方法，但沒有一種方法是普遍有效的。所以在采用每一種方法時必須對其效果以及對細胞可能產生的毒性影響進行監測。Del6Guidice和Gardella提出了一個有效的方法，其基本步驟包括首先分離、鑒定污染物及測定對抗生素的敏感性，然后使用至少兩種敏感的抗生素進行處理。為增加排除污染的有效性，可以通過稀釋以降低血清及其它促生長因子的濃度，從而降低細胞的密度。治療后細胞應在無抗生素條件下培養若干代，以確定污染已被徹底清除。細胞培養過程中支原體污染不易察覺，細胞被支原體污染后清除非常困難，支原體污染的細胞在支原體被清除后，其細胞特性會發生很大改變，對研究結果造成嚴重影響因此，為了保證細胞培養體系免受污染的影響，關鍵是加強預防措施。