細胞培養的注意事項（二）

13.如何選擇正確的血清種類？

14.可否使用與原先培養條件不同的血清種類？

不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

15.血清滅活是否必須？

這個問題現在有爭議。有人主張價格不菲的血清中含有諸如生長因子，維生素，氨基酸等珍貴物質，而將它們置于50℃以上的溫度長達30分鐘的熱處理會對血清中的生長因子，氨基酸等成分帶來的負面影響。盡管如此，在大多數實驗室之中血清的熱滅活還是作為常規來執行，尤其是在昆蟲細胞和胚胎干細胞培養中。

16.培養基中是否添加抗生素？

除特殊篩選系統中外，一般正常培養狀態下，培養基中不應添加任何抗生素。

17.何時更換培養基？

視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數據上的更換時間，按時更換培養基即可。

四、細胞傳代

18.細胞傳代的方法都有哪些？

根據不同的細胞采取不同的方法。貼壁生長的細胞用消化法傳代；部分貼壁生長的細胞用直接吹打即可傳代；懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打。

19.原代培養的首次傳代應注意的問題？

細胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不要急于傳代；原代培養時細胞多為混雜生長，不同的細胞有不同的消化時間，因此要根據需要注意觀察及時處理，并根據不同細胞對胰蛋白酶的耐受時間而分離和純化所需要的細胞；

吹打細胞時動作要輕巧盡可能減少對細胞的損傷；首次傳代時細胞接種數量要多一些，使細胞能盡快適應新環境而利于細胞生存和增值；隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養瓶。

20.使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的？應如何處理？

EDTA作用較胰蛋白酶緩和，主要作用在于能從組織生存環境中吸取Ca2+、Mg2+，這些離子是維持組織完整的重要因素。但EDTA單獨使用不能使細胞完全分散，因而常與胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果較好。常用比例為1：1或者2份EDTA：1份胰蛋白酶。EDTA的工作液濃度為0.02%，用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置。如果使用EDTA，在終止消化前，需用緩沖液將消化液清除后才能加培養液。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于 –20 ℃，避免反復冷凍解凍造成胰蛋白酶的活性降低，并可減少污染的機會。

21.欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？

欲回收動物細胞，其離心速率一般為800~1000 rpm，5~10 分鐘，過高的轉速，將造成細胞死亡。

22.細胞的接種密度為何？

依照細胞株基本數據上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長的重要原因之一。

23.細胞交叉污染的可能原因？

多種細胞系進行維持傳代操作時，各細胞系所需的器材和溶液沒有嚴格分開，往往會使一種細胞被另一種細胞污染。

五、細胞凍存

24.冷凍培養基為什么要加DMSO？

因為細胞在不加任何保護劑的情況下直接凍存時，細胞內外的水分都會很快形成冰晶，冰晶的形成將造成細胞損傷，還可引起細胞的的死亡。目前多采用甘油和DMSO做保護劑。這兩種細胞無明顯毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高包膜對水的通透性。

25.DMSO 的等級和無菌過濾的方式為何？

冷凍保存使用的 DMSO 等級，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO，其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于 4 ℃，避免反復冷凍解凍造成 DMSO 的裂解而釋出有害物質，并可減少污染的機會。若要過濾 DMSO，則須使用耐 DMSO 的 Nylon 材質濾膜。

26.欲冷凍保存時，細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？

冷凍管內細胞數目一般為 1x106 cells/ml vial，融合瘤細胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。

27.冷凍保存細胞的方法？

冷凍保存方法一：冷凍管置于 4 ℃ 30~60 分鐘 →-20 ℃ 30 分鐘 → -80 ℃ 16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽 vapor phase 長期儲存。

冷凍保存方法二： 冷凍管置于已設定程序的可程序降溫機中每分鐘降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 長期儲存。–20 ℃ 不可超過 1 小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入 –80 ℃ 冰箱中，存活率稍微降低一些。

28.細胞凍存太多會不會浪費？

每一種細胞系都應有充足的凍存儲備，防止由于細胞污染等因素造成的細胞系的絕種，而且每一批次培養的細胞狀態都不同，應該挑選幾個狀態較好的批次凍存保種。另外二倍體細胞等有限細胞系如果暫時不用最好凍存以免傳代太多，造成細胞衰老或者發生改變。

29.如何識別和預防常見的細胞污染？

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