細胞增殖檢測：3H同位素滲入法實例

血細胞淋巴細胞

RPMI-1640 細胞培養液2-巰基乙醇青霉素鏈霉素刀豆蛋白AHank's液PBS緩沖液3H-TdR

篩網96孔培養板手術器械二氧化碳培養箱超凈工作臺液體閃爍儀多頭細胞取集器49型玻璃纖維濾紙

1. 外周血單個核細胞的采集

（1） 用血細胞分離機采集患者自身的外周血單個核細胞 80 - 100ml；

（2） 淋巴細胞分離液密度梯度離心法進一步純化單個核細胞（PBMC）。

（3） 無血清培養液洗滌 2 次，獲得純度在 90%以上的 PBMC，細胞數量需達到 1-3 x10⁸

2. 腫瘤抗原的制備

（1） 手術切除腫瘤標本，無菌條件下，將壞死組織和癌旁非腫瘤組織去除干凈；

（2） 無菌生理鹽水洗 3 次；

（3） 用無菌的組織剪將腫瘤組織剪碎，加入 RPMI 1640 培養基，充分研磨；

（4） 200 目無菌網過濾后收集單細胞懸液；

（5）用 RPMI 1640 培養基重懸細胞至 1-2 x10⁷/ml，裝入 5ml 無菌凍存管中；

（6）將凍存管浸入液氮中速凍，10 min 后取出，再迅速放入 37℃ 水浴中解凍 10 min。反復 3-5 次；（注：也可以-80℃/37℃ 反復凍融 3-5 次。）

（7） 將腫瘤裂解物加入離心管中，3000rpm，離心 10min；

（8） 收集上清，0.22μm 濾膜過濾除菌，留樣檢測蛋白含量及細菌、真菌和支原體；

（9） -80℃保存備用。

3. DC細胞的培養

（1）步驟 1 中獲得的 PBMC 用無血清培養液調整細胞濃度至 2 x10⁶/ml，置于培養瓶內；

（2）37℃，5% CO2 培養箱中孵育 2h，以使單核細胞貼壁；

（3）洗去懸浮細胞，在貼壁細胞中加入含重組人 GM-CSF（500-1,000U/ml）和重組人 IL-4（500U/ml）的無血清培養液，37℃，5%CO₂培養箱中培養，誘導單核細胞向 DC 細胞分化；

（4） 每 2-3d 半量換液一次，并補足細胞因子；

（5）（可選步驟） 在培養的第 5d， 加入步驟 2 中獲得的腫瘤抗原 50 μg/ml，對 DC 進行抗原負載；（注：若不對 DC 進行抗原負載，該步省略。）

（6）在培養的第 6d，加入重組人 TNF-α（10ng/ml），IL-1β（10ng/ml），IL-6（1000U/ml）和PGE2（1μg/ml），誘導 DC 細胞成熟；

（7） 在培養的第 7d 或第 8d，收獲 DC 細胞，其數量應達到 1×10⁶個以上；

（8）DC 的質檢：

① 活細胞比例：臺盼藍染色驗證活細胞應在 90%以上；

② 形態學觀察：>90%細胞半懸浮，細胞有多個樹突樣突起；

1. DC來源廣泛，對實驗的結果影響很大，來源包括，外周血單核細胞（Monocyte）、臍帶血 CD34+細胞、骨髓和胎肝等，但因外周血單核細胞最容易獲取、數量也最多，所以臨床上被廣泛用作 DC 的來源細胞。

2. DC 的成熟度兩種，即 iDC 和 mDC，而 DC 的抗原遞呈能力與其成熟狀態密切相關。iDC 的抗原攝取和加工能力較強，但抗原遞呈能力很弱。在體外培養時，iDC 去除細胞因子（即 GM-CSF 和 IL-4）后，會逆轉為巨噬細胞，且即使在細胞因子的維持下，未成熟 DC 的功能也不是激活 T 細胞，而是抑制 T 細胞的增殖。mDC 則正好相反，其抗原攝取和加工能力很弱，但具有很強的抗原遞呈能力。因而可以激活 T 細胞，引起免疫反應。而且 DC 成熟后即使在培養體系中去除細胞因子，仍能保持 DC 的狀態和功能，不會發生逆轉。因此可以看出，DC 必須完全成熟后才能用于免疫治療。

3.樹突細胞的觀察：樹突細胞的觀察需要借助透射電鏡，透射電鏡可見DCs伸展的突起，掃描電鏡還可以拍攝到DC正在捕捉凋亡小體。

1. 從 DC 的祖細胞（如單核細胞）誘導分化為未成熟 DC：IL-4 在由單核細胞誘導成 DC 的過程中發揮的作用是抑制巨噬細胞的過度生長，從而引導單核細胞向 DC 方向分化。 若培養體系中不加 IL-4，單核細胞將分化為巨噬細胞。同時，IL-4 還有降低細胞表面表達 CD14 分子的能力。CD14 表達水平的降低是單核細胞分化為 DC 的重要標志。

2. 從 iDC 誘導分化為成熟 DC ：TNF- ，IL-1 和 IL-6 均為促炎癥因子，在感染局部和腫瘤部位被誘導產生。體外研究表明，這 3 種細胞因子均可下調未成熟 DC 的巨胞飲作用和表面 Fc 受體的表達，使細胞內 MHC II 類分子區室（class II compartment）消失，但能夠上調細胞表面 MHC I類、II 類分子和 B7 家族分子（CD80, CD86 等）的表達， 使未成熟 DC 分化為成熟 DC，此時 DC 的抗原攝取和加工能力明顯減弱，而抗原遞呈能力顯著增強，可極強地激活 T細胞。TNF- IL-1 IL-6 三因子組合可在無牛血清培養條件下誘導 DC 的完全成熟，從而制備出可以應用于臨床的 DC。

3. 樹突細胞的提呈抗原的方法主要有①抗原多肽刺激的DCs②酸提抗原刺激的DCs③腫瘤抗原編碼基因導入DCs④腫瘤mRNA刺激的DCs⑤細胞因子基因修飾DCs及其與腫瘤細胞融合。