細胞外囊泡 |
細胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是指從細胞膜上脫落或者由細胞分泌的雙層膜結構的囊泡狀小體，直徑從40nm到1000nm不等。胞外囊泡主要由微囊泡（Microvesicles, MVs）和外泌體（Exosomes, Exs）組成，微囊泡是細胞激活、損傷或凋亡后從細胞膜脫落的小囊泡，直徑約為100nm – 1000nm； |
外泌體由細胞內的多泡小體（multivesicular bodies）與細胞膜融合后以外分泌的形式釋放到細胞外，直徑約為40nm - 100nm。細胞外囊泡廣泛存在于細胞培養上清以及各種體液（血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁）中，攜帶有細胞來源相關的多種蛋白質、脂類、DNA、mRNA、miRNA等，參與細胞間通訊、細胞遷移、血管新生和免疫調節等過程。在糖尿病、心血管疾病、艾滋病、慢性炎癥疾病以及癌癥中都發現細胞外囊泡水平的升高，它們很有可能成為這類疾病的診斷標志物，因此，對細胞外囊泡進行準確的定性和定量研究顯得尤為重要。 |
細胞外囊泡的檢測方法 |
目前細胞外囊泡（EVs）的檢測方法主要有掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡、動態光散射技術、納米微粒追蹤分析術（NTA）、流式細胞儀和ELISA等，由于通量高、用時短、操作簡單，ELISA和流式細胞儀是比較常用的方法。 ELISA方法容易受其他可溶性抗原的干擾，而且無法知道囊泡的大小、數量等信息；流式細胞儀不僅可以檢測囊泡的大小、數量，而且通過細胞特異的標記物染色可以檢測囊泡的來源，將囊泡進行分類，因此，流式細胞儀理論上是進行囊泡快速、高通量、多參數檢測的最優選擇。 然而，傳統流式細胞儀針對的樣本主要是細胞，散射光的檢測極限通常是300-500nm，而大多數細胞外囊泡的直徑都在300nm以下，由于無法與背景噪音區分，直徑小于300nm的細胞外囊泡很難被檢測到，因此，囊泡數量往往被低估，檢測結果自然也不準確[1]。 |
Apogee流式細胞儀的三大優勢 |
（1）最靈敏的散射光分辨率 |
英國Apogee公司的A50-Micro突破傳統流式細胞儀的檢測極限，優化的光學模塊和優異的散射光檢測能力使得A50-Micro具有無法匹敵的靈敏度（<100nm）和最好的光散射分辨率（10nm）。 通過前向角散射光FC500只能勉強區分0.5μm和0.9μm的微珠，0.5μm以下的微珠則完全無法區分；Gallios和Influx在散射光檢測能力方面有所提高，可以區分0.3μm和0.5μm的微珠，但0.3μm以下的微珠還是無法區分；而Apogee A50-Micro可以輕松地將0.14μm的微珠和0.3μm的微珠分成兩個群（Fig 1.A）。無論是FC500還是Gallios或Influx都只能部分的將0.3μm的微珠與背景噪音區分開，而A50-Micro可以清晰地將0.3μm的微珠與背景噪音完全區分開（Fig1.B中綠色數據點），并且只有A50-Micro可以檢測到0.14μm的微珠。 這些結果說明，利用Apogee A50-Micro突出的高靈敏度和分辨率，我們可以輕松地將直徑相差10nm以上的細胞外囊泡樣本進行分群、計數、分析。另外，多達9通道熒光檢測器，可以靈活使用細胞外囊泡特定抗原熒光抗體進行囊泡來源、數量的精確分析。Apogee A50-Micro是市場上唯一能夠通過散射光檢測小至100nm小顆粒的流式細胞儀，在細胞外囊泡的檢測上優于任何一個競爭對手。 |
Figure 1. Technological improvement in forward scatter (FS) for microparticle (MP) measurement: (A) Beads resolution improvement: FS distribution of a blend of fluorescent latex beads (0.1/0.14, 0.3, 0.5 and 0.9 μm) with a threshold on fluorescence. (B) Background noise reduction: Scatters dot plot showing blue (0.9 μm beads), red (0.5 μm beads), green (0.3 μm beads) and violet (0.1/0.14 μm beads) beads with a FS threshold. Grey dots are background noise. |
（2）ZL的折射率校正功能 |
利用流式細胞儀進行細胞外囊泡檢測往往需要使用標準微球（microspheres）來校正和設門（Set Gate），常用的微球材料有聚苯乙烯（Polystyrene）和二氧化硅（silica），國際血栓與止血協會和標準化委員會（ISTH SSC）推薦用于循環微粒（微囊泡）檢測設門的Megamix就是聚苯乙烯微球。但是，最近越來越多的研究人員發現，用標準微球進行設門存在很嚴重的偏差，因為不同材料的微球的折射率（refractive index）是不一樣的，相同直徑的微球，折射率越大產生的散射光就越強。而且微球的折射率要遠遠大于生物囊泡的折射率，意味著微球產生的散射光強度是相同直徑囊泡的幾十倍。實際上，0.5mm聚苯乙烯微球（Megamix）產生的散射光強度相當于1.4mm的囊泡，而2.7mm的囊泡才能產生跟0.9mm聚苯乙烯微球（Megamix） 相當強度的散射光（表1）[2]。因此，如果我們用0.5mm的聚苯乙烯微球（Megamix）設門來檢測小于0.5mm的細胞外囊泡將產生嚴重的偏差，檢測結果也是不可信的。 |
*FSRI, forward scatter relative intensity measured on the Apogee A40. **Diameter of a lipid or cellular microparticle with the same forward scatter relative intensity as the particle that was measured. Equivalent microparticle diameter (mm) = 3.2911(PD) - 0.2768, where PD = polystyrene microsphere diameter (mm). |
為了解決這一問題，Apogee的工程師們研發了ZL的折射率校正功能，無論是單參數的柱狀圖（Histogram）還是雙參數的散點圖（Cytogram），只要單擊右鍵選擇“Choose Calibration Scale”就會出現一條校正大小的標尺，并且可以根據檢測樣本的折射率來選擇相應折射率的標尺，那么我們就可以根據樣本的直徑大小和折射率這兩個參數來設門和選擇我們感興趣的區域（region of interest, ROI），得到真實可靠的結果。 |
（3）不依賴于抗體微珠的外泌體檢測能力 |
由于外泌體（exosomes）的直徑特別小（40 - 100nm），超出了傳統流式細胞儀的檢測范圍，為此，很多公司提供了特異抗體標記的微珠用于外泌體的富集和流式分析，但這種方法的局限是操作復雜，對抗體特異性要求很高，而且無法知道外泌體的絕對數量。而Apogee A50-Micro超高的靈敏度和分辨率使其可以直接對樣本中的外泌體進行分析和計數，操作簡單，結果準確，美國個性化醫療的領軍生物技術公司Caris Life Sciences正是利用A50-Micro來檢測和分析復雜病人樣本中的微囊泡和外泌體[3]。一流企業的選擇，值得您的信賴！ |
[1] Lacroix R, Robert S, Poncelet P, Dignat-George F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Semin Thromb Hemost. 2010 Nov;36(8):807-18. |