細胞外miRNAs：從生物標志物到生理和疾病的調節因子

miRNAs可在血清和其他體液中發現，并可作為疾病的生物標志物。更重要的是，分泌型miRNAs，尤其是胞外囊泡(EVs)如外泌體分泌的miRNAs，可能介導不同組織間的旁分泌和內分泌通訊，從而調節基因表達和遠程調控細胞功能。分泌型miRNAs受影響時可能會導致組織功能障礙、衰老和疾病。 脂肪組織是循環外泌體miRNA的重要來源。 在許多代謝條件下發生的脂肪組織質量或功能的改變可以導致循環miRNA的改變，從而引起機體一系列的功能改變。
這篇綜述回顧了得出這些結論的研究，并討論了如何為新的研究奠定基礎，有助于進一步確定細胞外miRNA作為細胞間通訊的重要介質如何發揮強大作用。

綜述分為以下幾個部分：

MicroRNAs (miRNAs)是由體內各種細胞產生的約22個nt的調節性非編碼小RNA。許多miRNAs在進化過程中高度保守，盡管它們的多樣性和數量與機體的復雜性相關。秀麗隱桿線蟲的基因組包含437個miRNAs，小鼠超過1500個，而人類的miRNAs在2000到3000個之間(數據來自miRBase，第22版)。許多miRNAs可以無所不在地表達，而其他的則具有組織特異性。這種分布模式是由細胞內miRNA前體的轉錄和轉錄后調控所驅動的。

在細胞核中，初級miRNAs(pri-miRNAs)被RNA聚合酶II轉錄，然后由微處理器復合物(內含核糖核酸內切酶DROSHA及其RNA binding partner DGCR8)或剪接機制的組件進行處理。這導致了約70個nt的pre-miRNAs，被XPO5和Ran GTPase輸出到細胞質中。pre-miRNAs被III型核糖核酸內切酶DICER和RNA結合蛋白TRBP與PACT共同處理，產生雙鏈miRNAs duplex。這些miRNAs duplex被加載到RNA誘導的沉默復合體（RISC），在RISC中，Argonaute-2 (AGO2)及其分子伴侶HSC70/HSP90介導雙鏈miRNAs duplex的一條鏈與其靶mRNA結合（另一條鏈一般很快被降解了），抑制mRNA的翻譯和/或加速mRNA的降解。也有一些miRNAs發揮非常規的相反作用：誘導轉錄和上調蛋白表達的。不依賴DICER的miRNA生成也有報道，但它們的影響有限。

與mRNAs類似，miRNA表達譜也可作為細胞標志物。例如，miR-122在肝臟中高度表達，占該組織中總miRNA表達量的70%。肌肉細胞中富含miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-206、miR-208a、miR-208b、miR-486和miR-499，因此這些miRNAs被稱為myomiRs；miR-9和miR-124幾乎完全在大腦中表達，后者占了該組織中近50%的miRNA含量；而β細胞是唯一高豐度表達miR-375的細胞。另一方面，一些細胞，如脂肪細胞和干細胞，表達多種miRNAs。

為了理解miRNAs 的表達如何在特定細胞類型中促進該組織的發育和穩態，產生了多種 細胞類型特異性DICER或DGCR8敲除小鼠 。中樞神經系統、胰腺、骨骼肌和心肌的DICER敲除使小鼠不能成活或出現嚴重的發育缺陷。而肝臟特異性DICER敲除小鼠(LDicerKO)和脂肪細胞特異性敲除小鼠DICER (ADicerKO)或DGCR8 敲除小鼠(ADgcr8KO)在成年之前與野生型的幼鼠難以區分，直到它們開始出現代謝功能障礙。包括LDicerKO小鼠肝脂質沉著癥和早發性肝細胞癌；ADicerKO和ADgcr8KO小鼠部分出現脂肪營養不良和胰島素抵抗。許多表型是因為miRNAs生成受阻改變mRNA半衰期和細胞的翻譯功能，但是有一些表型因為其他組織中基因表達和功能的變化引起的二級改變，提示細胞非自治組織miRNAs損失的影響。當ADicerKO小鼠移植正常脂肪組織后，其肝臟基因表達發生逆轉，提示這些變化受脂肪組織分泌的miRNAs調控。這種現象產生一個假象：每個細胞的miRNAs是內源性miRNAs產生和外源性miRNAs攝取的總和。要證實這一假設，就需要發展穩健的技術來追蹤miRNAs起源和運輸。

miRNAs可以通過囊泡轉運和蛋白載體的機制被細胞輸出和導入是miRNAs具有潛在的細胞和組織間通訊作用的強有力支持。這個概念最早是由Valadi等人在 2007年 提出的，他們在不同細胞系分泌的胞外囊泡(EVs)中識別出大量的mRNAs和miRNAs，這些囊泡可以被其他細胞吸收，然后將mRNAs和miRNAs釋放到靶細胞中。 2010年 有研究表明，體液中存在miRNAs，且它們的水平與疾病進展相關。從那時起， 細胞外miRNAs轉運機制 被廣泛研究，目前已知 的兩條主要途徑 是： (1)通過EVs主動轉運；(2)作為蛋白-miRNA復合物的一部分轉運 。此外，可能有一些miRNAs是從破損或受損的細胞中泄漏出來的。

通常，多泡體(MVBs)與質膜融合產生的較小的EVs ( < 200nm )稱為外泌體(圖1)，而質膜直接向外出芽和裂變形成的較大EVs ( > 200nm )稱為微囊泡。直接出芽也能產生類似外泌體的小泡，被稱為梭狀囊泡或胞外體。

除EVs外，miRNAs還可能在含有蛋白復合物的血液中被運輸。這些復合物也可以進入細胞并傳遞miRNAs來抑制靶mRNA。 低密度(LDL)和高密度(HDL)脂蛋白 都可以在循環中運輸miRNAs。在HDLs的情況下，結合的miRNAs可以通過B類I型清道夫受體被受體細胞吸收并在細胞內釋放從而調節受體細胞基因表達。
盡管EVs相關和脂蛋白結合的miRNAs在功能上很重要，但它們只是占循環中發現的所有miRNAs的一部分。在一些研究中，在人類血清中發現超過一半的miRNAs可能與核糖核酸蛋白結合，包括argonaute ( AGO2 )；然而，其中只有一小部分是通過這種方式運輸的。核仁蛋白核磷蛋白1 (nucleophosmin 1, NPM1 )也被發現可以攜帶和保護細胞外miRNAs不被降解。

生物標志物是一種可以用于疾病檢測和/或預后預測的分子。一個好的生物標志物最重要的四個特征是特異性、敏感性、穩定性和非侵入性。 循環miRNAs水平的變化與多種疾病相關，包括2型糖尿病(T2D)、肥胖、心血管疾病(CVD)、癌癥、神經退行性疾病等。

這部分內容參考我寫的 ChemicalReviews綜述 ，那里面有更詳細的描述。

脂肪組織的功能除了以甘油三酯的形式儲存能量外，還能分泌調控全身新陳代謝的分子來維持機體內環境平衡。這些分子包括脂肪產生的激素(被稱為脂肪因子)，信號脂質，炎癥介質和EVs miRNAs。 ADicerKO小鼠約三分之二的循環miRNAs顯著減少，這表明了脂肪組織對循環miRNAs庫的顯著貢獻。 患有各種脂肪營養不良的患者，其循環外泌體miRNAs也有顯著改變。重要的是，脂肪組織分泌的miRNAs已經被證明可以到達肝臟和肌肉等器官，并調節該組織基因和蛋白質的表達。
脂肪來源的循環miRNAs以內分泌方式控制代謝穩態的一個例子是2017年Thomou等人通過脂肪來源的miR-99b調控肝臟FGF21。 ADicerKO小鼠循環EVs中的miR-99b水平降低，肝臟中Fgf21 mRNA及3' UTR-報告基因活性的上調，這兩種現象可通過往循環中加入含有 miR-99b 的EVs顯著糾正。ADicerKO小鼠還顯示出其他組織(包括肌肉、β細胞和骨骼)功能障礙，以及全身胰島素抵抗。 但具體是哪些循環外泌體miRNAs參與了這些表型仍有待確定。
其他研究表明，來源于脂肪EVs的miRNAs也可以發揮旁分泌功能。從含有 miR-16、miR-27a、miR-146b和miR-222 的大脂肪細胞中釋放的EVs可以轉移到小脂肪細胞中，從而刺激其脂肪生成和脂肪細胞肥大。脂肪細胞分泌這些miRNAs是由游離脂肪酸和H 2 O 2 誘導的，在老年小鼠的血清中這些miRNAs表達上調。這些結果提示促進脂質積累和胰島素抵抗的信號可能通過脂肪細胞的分泌miRNAs從胰島素抵抗的脂肪細胞向新形成的脂肪細胞傳播。肥胖患者的多種脂肪組織衍生的循環miRNAs(通過含脂肪特異性蛋白FABP4的細胞外顆粒的親和純化鑒定)在減肥手術一年后發生了顯著變化。估計這些miRNAs可靶向WNT/β-catenin和胰島素信號通路的成分。減肥手術后差異表達的miRNAs中， let-7a和miR-16 的靶標涉及胰島素受體信號傳導，并且這些miRNAs的水平與支鏈氨基酸（BCAA）的水平相關，表明它們可能與全身胰島素抵抗相關。

胰島細胞不僅可以通過分泌胰島素和胰高血糖素來控制代謝，還可以通過分泌miRNAs來控制代謝。 初級胰島細胞和β細胞來源的MIN6細胞在收到胰島素分泌刺激時可釋放特定的miRNAs。例如，與瘦組相比，肥胖ob/ob小鼠的血清、胰島、肝臟和骨骼肌中 miR-223 表達上調。但其前體pri-miR-223僅在胰島中升高，這表明其他組織中成熟miR-223水平升高來源與胰島。miR-223已被證明能與 Glut4 mRNA的3' UTR結合，下調脂肪組織中的GLUT4( 葡萄糖的代謝取決于細胞對葡萄糖的攝取，然而，葡萄糖無法自由通過細胞膜脂質雙層結構進入細胞，細胞對葡萄糖的攝入需要借助細胞膜上的葡萄糖轉運蛋白（glucose　transporters）簡稱葡萄糖轉運體（GLUT）的轉運功能才能得以實現。GLUT4就是其中的一種形式 )，上調心肌細胞的GLUT4表達。
miR-155、miR-142-3p和miR-142-5p 可能從T淋巴細胞來源的EVs轉移到β細胞，導致炎癥通路、細胞凋亡的激活和胰島素缺乏性糖尿病的發生。

人單核細胞在促炎刺激后分泌的EVs具有高水平的 miR-150 。用這些EVs孵育微血管內皮細胞可下調miR-150靶基因c-Myb，這是一種參與內皮細胞遷移的轉錄因子。miR-150在體外過表達可誘導內皮細胞遷移，這種作用可通過動脈粥樣硬化患者（miR-150水平上調）血漿中的EVs孵育來模擬。來自血管平滑肌細胞的EVs已被證明能夠促進 miR-155 向內皮細胞的轉移，通過降低緊密連接蛋白的水平來影響內皮屏障的完整性。暴露于氧化的低密度脂蛋白（LDL）的內皮細胞分泌的EVs高表達miR-155，miR-155可以將巨噬細胞的極化從M2樣表型轉移到促炎性M1樣表型。血清和心臟中 miR-126 水平的變化被認為通過影響MCP-1和VCAM-1的表達而在心功能障礙中發揮作用。這些過程改變內皮功能，促進動脈粥樣硬化。

越來越多的證據表明，循環EVs可能穿過室管膜層和血腦屏障(BBB)作用于中樞神經系統，從而發揮組織間通訊的作用。老齡大鼠鼻腔給藥含 miR-219 的血清EVs可增加中樞神經系統的髓磷脂含量。改變血腦屏障(BBB)通透性的神經退行性疾病可以促進大腦循環miRNAs與血液循環miRNAs的交換。也有證據表明 EVs可以通過胞吞機制穿過血腦屏障 。許多細胞外miRNAs被認為是神經退行性疾病的疾病生物標志物，盡管它們在這些疾病的病理生理學中的作用尚不確定。 衰老會影響下丘腦干細胞分泌EVs miRNAs，而腦室內注射下丘腦干細胞分泌產生的EVs能夠延緩下丘腦衰老。（湯老師的Nature文章） 含有miRNAs的EVs也涉及神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞和內皮細胞之間的相互作用。2018年，Huang等人發現腦損傷后小膠質細胞EVs 中miR-124水平升高，觀察到這個miRNA可以轉移到神經元中發揮抑制神經元炎癥和促進神經元突觸生長的作用。

盡管這個領域還很年輕，但細胞外miRNAs作為細胞間通訊的生理機制的概念卻令人興奮并受到關注，使用細胞外miRNAs更好地對疾病分期以及治療的前景也是如此。目前，開發合適的工具和標準化的方法來評估miRNAs的運輸和交付是該領域的瓶頸，但是在未來幾年可能被克服。克服這些障礙將把這一領域帶入一個新的高度：特定的細胞外miRNAs可被視為不同生理和病理生理狀況的生物標志物，而外泌體或其他EVs中的miRNAs可被用于以一種特定而有效的方式治療疾病。

感覺這篇綜述的質量不如我寫的上一篇 ChemicalReviews綜述 ，那篇更全面，并且對某些方面描述也更具體。不過這篇也可以學到少量那篇綜述沒涵蓋到的知識點。