三、 腦微血管段的分離與腦微血管內皮細胞原代培養
1. 大鼠頸椎脫臼處死后浸泡于75%乙醇中消毒3~5 min后斷頭置于玻璃培養皿中，打開顱腔后取出全腦置于盛有冷D-Hanks'液的玻璃培養皿中解剖去除小腦、間腦(包括海馬)。2. 隨后將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以吸除軟腦膜及腦膜大血管后置于新的含冷D-Hanks'液玻璃培養皿中，用細解剖鑷去除大腦白質、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質。3. 用D-Hanks'液漂洗3次后，加入1 ml DMEM培養液，用虹膜剪將其剪碎成1 mm3大小，加入0.1%Ⅱ型膠原酶(含30 U/ml DNase I，1 ml/大腦)混勻后37 ℃水浴消化1.5 h。4. 離心(1 000 rpm，8 min，室溫)，去上清液，加入20% BSA懸浮混勻后離心(1000 g，20 min，4 ℃)或加入15%葡聚糖懸浮混勻后離心(4 000 rpm，20 min，4 ℃)，去除中上層神經組織及大血管，保留底部沉淀。5. 加入2 ml 0.1%膠原酶/分散酶(含20 U/ml DNase I)懸浮混勻后37 ℃水浴消化1 h，離心(1 000 rpm，8 min，室溫)，去上清液，加入2 ml DMEM培養液懸浮后鋪于經離心形成連續梯度的12 ml 50% Percoll(25 000 g，60 min，4 ℃)。6. 離心(1 000 g，10 min，4 ℃)，靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后用DMEM漂洗兩次(離心1 000 rpm，5 min，室溫)，去上清液。7. 加入DMEM完全培養液(含20% FBS，100 μg/ml肝素鈉)懸浮后接種于涂布基質的35 mm一次性塑料培養皿(1.5 ml/培養皿，可接種1個培養皿/大腦)，置于37 ℃、5%CO2培養箱內靜置培養，12~24 h后換液，并加入1 ng/ml bFGF，隨后隔天換液。
四、鑒定方法
形態學、Ⅷ因子相關抗原免疫組織化學檢測。
五、 結果
1. 細胞形態觀察
接種當時可見由圓形的內皮細胞構成的呈單枝狀或分枝狀的腦微血管段，并可見散在的單細胞及組織碎片(見圖1-1)；培養12~24 h后可見培養的細胞從貼壁的微血管段周圍長出，細胞呈短梭形，區域性單層生長，經換液后微血管段的殘余部分不斷減少，成纖維細胞、周細胞等雜細胞含量較少；隨著培養時間的延長，內皮細胞不斷增殖，可見"漩渦"分布，大約5~7天細胞達到融合，短梭形的內皮細胞占90%以上，但可見少量周細胞等雜細胞生長于內皮細胞單層表面或細胞克隆間隙(結果未顯示)。細胞生長過程見圖1，細胞接種于纖連蛋白/Ⅳ型膠原涂布的培養皿。
2. 涂布不同基質的細胞生長情況
明膠及鼠尾膠涂布的培養皿微血管段貼壁時間較長，6 h時可見少量微血管段貼壁但無內皮細胞長出，12~24 h可見一些內皮細胞長出，24 h后腦微血管段完全貼壁并有較多的內皮細胞長出，兩者無明顯差異(見圖2-1~4)；纖連蛋白/Ⅳ型膠原涂布的培養皿培養后6 h即可見微血管段貼壁并有一些內皮細胞長出，12~24 h內基本完全貼壁并有較多的內皮細胞長出(見圖2-5,6)。
