細胞提取物中β半乳糖苷酶的測定實驗

轉染了感興趣 DNA 的哺乳動物培養細胞

大腸桿菌β-半乳糖苷酶Tris-Cl磷酸鈉ONPGNa2CO3β-巰基乙醇MgCl2

材料

緩沖液和溶液
貯存液稀釋到適當濃度。

100XMgCl₂
0.1mol/L MgCl₂

4.5mo1/L β-巰基乙醇
臨用前，加入適量的 14.7mol/Lβ-巰基乙醇貯存液。

Na₂CO₃(1mol/L)
10.6 g 無水固體溶于 100 ml 水中。

1xONPG
ONPG 溶于 0.1mol/L 磷酸鈉（pH7.5) 中，濃度為 4 mg/ml。

磷酸鈉（0.1mol/L，pH7.5）
混合 41 ml 0.2mol/L Na₂HPO₄?2H₂O(M_t=178.05;35.61 g/L)，9 ml 0.2mol/L NaH₂PO₄?2H₂O(M_r=156.01;31.21 g/L) 和 50 ml 水。

Tris-Cl(1mol/L,pH7.8)



酶和緩沖液

大腸桿菌β-半乳糖苷酶
該酶是商品化的（如 Sigma 公司)

附加試劑
本方案步驟 1 需要列在本章方案 5 中的試劑。

細胞和組織

轉染了感興趣 DNA 的哺乳動物培養細胞
使用第 16 章的某種轉染方案，用帶有半乳糖苷酶報道基因的質粒（如 CLONTECH 公司的報道分子系列載體；請見圖 17-5) 轉染細胞。



方法

1. 如方案 5 步驟 1~4 所述，用轉染的細胞制備細胞抽提物。取約 30ul 抽提物測定β-半乳糖苷酶。所需抽提物的確切數量要根據驅動β-半乳糖苷酶基因表達的啟動子的強度、轉染效率和測定時的孵育時間來確定。如果要用熱處理滅活內源性β-半乳糖苷酶，測定前把細胞裂解物在 50°C 孵育 45~60 min。預熱處理也會使熒光素酶失活，所以如果使用預熱處理，熒光素酶和β-半乳糖苷酶活性測定要分開用不同一份細胞裂解物進行。

2. 對于每個用于測定的轉染細胞裂解物樣品，混合：

100xMg²⁺溶液                        3ul
1xONPG                                 66ul
細胞抽提物                             30ul
0.1mol/L 磷酸鈉（PH7.5)       201ul

陰性和陽性對照都是必需的，它們分別檢査內源性抑制劑和β-半乳糖苷酶是否存在。所有對照實驗應該含有 30ul 假轉染細胞的裂解物。此外，陽性對照應該包括 1ul 商品化的大腸桿菌β-半乳糖苷酶制品<50 單位/ml。商品化的酶制品應該溶在 0.1mol/L 磷酸鈉（PH7.5) 中，濃度為 3000 單位/ml。臨用前，把 1ul β—半乳糖苷酶貯存液加到 60ul 0.1mol/L 磷酸鈉（PH7.5) 中配成 50 單位/ml 的酶工作液。每單位大腸桿菌半乳糖苷酶定義為在 37°C，1 min 內水解 1umol ONPG 底物的酶量。

3. 反應液在 37°C 孵育 30 min 或者直到淡黃色出現。大多數細胞類型中，內源性β-半乳糖苷酶的背景非常低，允許孵育時間長到 4~6 h。

4. 每個管子加入 500ul 1mol/L Na₂CO₃ 使反應終止。在分光光度計上讀 420nm 波長的光密度值。
測量的線性范圍是 0.2~0.8OD₄₂₀。如果測量值在線性范圍外, 用少一些蛋白抽提物進行重復實驗。抽提物可以用 0.25mol/L Tris-Cl(pH7.8) 稀釋以減低蛋白濃度。