欄主要分為基因操作工具、細胞實驗部分、動物模型部分、組織水平部分、分子機制部分和實驗方案范例六大專題。接下來將為大家分享細胞生物學的細胞增殖相關研究方法。
MTT分析法
MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細胞色素C的作用下tetrazolium環開裂，生成藍色的formazan結晶，formazan結晶的生成量僅與活細胞數目成正比（死細胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原）。
實驗方法
接種XXX細胞用含10%胎小牛血清得培養液配成單個細胞懸液，以每孔1000-10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200 μL。培養細胞同一般培養條件，培養3-5天（可根據試驗目的和要求決定培養時間）。呈色培養3－5天后，每孔加MTT溶液（5 mg/mL用PBS配）20 μL。繼續孵育4小時，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分融解。比色選擇490nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。
XTT
XTT是一種與MTT類似的四唑氮衍生物，可被活細胞線粒體脫氫酶還原成水溶性的棕色甲肷產物，當XTT與電子偶合劑共同使用時，甲肷的生成量與細胞的增殖程度呈正相關。
實驗方法
首先配置6.6 mmol/L XTT溶液和220 mmol/L吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)溶液。臨用時將XTT與PMS按1：1混合，形成XTT/PMS。接種XXX細胞：用含10%胎小牛血清得培養液配成單個細胞懸液，以每孔1000-10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200 μL。培養細胞：同一般培養條件，培養3-5天（可根據試驗目的和要求決定培養時間）。于終止培養前2 h，每孔加入XTT/PMS 20μL，混勻后再培養2 h。在酶標儀上450 nm處測定光吸光度，參考波長為655nm。
WST-1
此法是用于測定細胞增殖或毒性試驗中活細胞數目的一種高靈敏度、高穩定性且無放射性的比色檢測法。實驗的靈敏度比其它四唑鹽如MTT，XTT，MTS高，線性范圍更寬。
實驗方法
在96孔板加入XXX細胞100 μL/孔（約1×104），置37℃ 5% CO2細胞培養箱培養24小時。加入適當濃度的受試化合物。將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養箱中孵育適當時間。采用WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒，向各孔中加入10 μL的四唑鹽工作液。37℃下孵育1～4小時。酶標儀在450nm波長處檢測每孔的光密度。
CCK-8是近年新開發的一種更新的水溶性四唑鹽檢測，原理與WST-1類似：在電子載體1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯鹽（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原成具有高度水溶性的橙黃色甲臜產物（Formazan）。生成的甲臜物的數量與活細胞的數量成正比，用酶聯免疫分析儀測定其光吸收值可間接反映活細胞數量，在一定細胞數量范圍內甲臜形成的量與細胞數成正比。
實驗方法
在96孔板中接種細胞懸液（100 μL/孔）。將培養板放在培養箱中預培養（37℃,5% CO2）。細胞經處理后。向每孔加入10 μL CCK溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數）。將培養板在培養箱內孵育1～4小時。用酶標儀測定在450nm處的吸光度。若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCl溶液或者1%w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24小時內測定，吸光度不會發生變化。
CCK-8(WST-8)
CCK-8是近年新開發的一種更新的水溶性四唑鹽檢測，原理與WST-1類似：在電子載體1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯鹽（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原成具有高度水溶性的橙黃色甲臜產物（Formazan）。生成的甲臜物的數量與活細胞的數量成正比，用酶聯免疫分析儀測定其光吸收值可間接反映活細胞數量，在一定細胞數量范圍內甲臜形成的量與細胞數成正比。
實驗方法
在96孔板中接種細胞懸液（100 μL/孔）。將培養板放在培養箱中預培養（37℃,5% CO2）。細胞經處理后。向每孔加入10 μL CCK溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數）。將培養板在培養箱內孵育1～4小時。用酶標儀測定在450nm處的吸光度。若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCl溶液或者1%w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24小時內測定，吸光度不會發生變化。
平板克隆形成
平板克隆形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過大。
實驗方法
取對數生長期的單層培養的XXX細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，把細胞懸浮在10%胎牛血清的RPMI1640培養液中備用。將細胞懸液作梯度倍數稀釋，以適當的細胞密度(根據增殖能力)接種于培養皿中。一般分每皿50、100、200個細胞的梯度密度分別接種含10mL 37℃預溫培養液的皿中，并輕輕轉動，使細胞分散均勻。置37℃ 5%CO2及飽和濕度的環境下，靜置培養2～3周。當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15min。然后去固定液，加適量Giemsa應用染色液染10～30min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，用肉眼直接計數克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計數大于50個細胞的克隆數。最后計算克隆形成率。克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%。
軟瓊脂克隆形成
軟瓊脂培養法常用檢測腫瘤細胞和轉化細胞系。試驗中瓊脂與細胞相混時，瓊脂溫度不宜超過40℃。接種細胞的密度每平方厘米不超過35個，一般6cm的平皿接種1000個細胞。正常細胞在懸浮狀態下不能增殖，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗。
實驗方法
取對數生長期XXX細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，作活細胞計數，用含20%胎牛血清的DMEM培養液調整細胞密度至1×106細胞/L。然后根據實驗要求作梯度倍數稀釋。用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃中不會凝固。按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃5%CO2溫箱中培養10～14天。把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞克隆數。計算形成率。
BrdU
BrdU是胸腺嘧啶的衍生物，常用于標記活細胞中新合成的DNA，可代替胸腺嘧啶選擇性整合到復制細胞中新合成的DNA中（細胞周期S期）。這種摻入可以穩定存在，隨著DNA復制進入子細胞中。BrdU特異性抗體可以用于檢測BrdU的摻入，從而判斷細胞的增殖能力。
實驗方法
將細胞密度為1.5×105/mL的XXX細胞接種于直徑35 mm培養皿中（內放置一蓋玻片），培養1天，用含0.4％FBS培養液同步化3天，使絕大多數細胞處于G0期。加入BrdU（儲液：1.0mg/mL，終濃度為0.03μg/mL），37℃，孵育40min。棄培養液，玻片用PBS洗滌3次。甲醇/醋酸固定10min。經固定的玻片空氣干燥，0.3%H2O2-甲醇30min滅活內源性氧化酶。5%正常兔血清封閉。甲酰胺100℃，5min變性核酸。冰浴冷卻后PBS洗滌，加1抗即抗小鼠BrdU單抗（工作濃度1：50），陰性對照加PBS或血清。按免疫組織化學常用的檢測方法ABC法進行檢測，蘇木素或伊紅襯染，在顯微鏡下隨機計數10個高倍視野中細胞總數及BrdU陽性細胞數，計算標記指數LI。