生物圈的小伙伴肯定還記得前段時間的一則刷屏新聞：
北京大學陳良怡教授團隊和華中科技大學譚山教授團隊合作，成功發明了一種新型結構光照明超分辨顯微成像技術——海森結構光照明顯微鏡。研究成果于高水平學術期刊Nature Biotechnology（IF=41.67）進行了發表。
之所以轟動，是因為該技術擁有超高的采集速度和靈敏度，以及低于共聚焦和其他超分辨成像方法（STORM/STED等）千分之一以上的光毒性和光漂白效應，成為了目前進行超長時間活細胞高速超分辨成像的利器。
而且，這個牛氣哄哄的技術一經發明，便已經奪得生物成像領域的好幾個“首次”：
· 首次在活體細胞中清晰解析出線粒體的內膜結構，以及線粒體融合與裂解過程中內膜的動態變化；
· 首次觀察到活體細胞中線粒體嵴與內質網之間的相互作用與運動；
· 首次通過連續成像的形式，捕捉到了完整的囊泡分泌與融合過程中的孔道及融合中間態。
那么究竟這臺高大上儀器是怎樣被研發而出？它爆炸性的技能點具體又是怎樣？接下來我們就來深度解讀一下啦！
實時觀察線粒體融合分裂及內膜動態變化
從1994年Stefen W. Hell提出STED顯微鏡理論，到2014年三位科學家因為超分辨顯微技術獲得諾貝爾化學獎。短短20年間，超分辨成像可以說是聲名大噪，各種超分辨成像平臺也幾乎成為了各大高校研究所的必備。
但是，一個奇怪的現象讓北京大學的陳良怡教授產生了疑惑：雖然遍地開花，但由超分辨成像技術所帶來的生物學新發現卻屈指可數。究竟是何種原因，限制了超分辨顯微成像在生物研究領域大顯身手？
目前，主流的超分辨成像技術主要有三類：
1、基于可隨機開關的單分子熒光閃爍定位的STORM/PALM方法；
2、基于熒光蛋白受激發射損耗原理的STED方法；
3、基于結構光調制與解調制圖像信息的SIM方法。
其中，STED通過純光學方法能夠獲得50
nm甚至更低的分辨率，不通過算法擬合重建，成像速率取決于共聚焦平臺的振鏡掃描速率。但是其明顯的弊端在于用于激發樣品的光功率是最強的（MW/cm2數量級，相當于100萬個太陽同時在天上炙烤你的皮膚）。如此一來，既會對樣品產生積累的光毒性，又容易在長時間的活細胞觀察過程中使樣品熒光淬滅。
STORM/PALM相對于STED來說光照條件要稍微溫和一些（kW/cm2數量級，大概也就相當于1000個太陽吧），分辨率也能到50
nm以下。但由于獲得一張超分辨圖片需要基于成百上千張原始的單分子閃爍圖像，并通過算法擬合重建。所以成像的速度也是制約其發展的重要原因。同時，STORM/PALM對于熒光標記物的選擇是非常苛刻的，因此幾乎不能在同一個樣品上實現多個蛋白的超分辨觀察。
但是另外一種超分辨率方法，基于莫爾條紋效應的SIM就不一樣了！
基于傅里葉光學和算法重建，SIM能夠用最低的光功率（W/cm2數量級）獲得長時間的活細胞超分辨圖像。同時它對熒光標記物也無選擇性，可以輕松實現多標記物觀察。最重要的是由于重建一張超分辨圖像只需要9-15張原始圖像，因此SIM也是在相同成像視野下最快的超分辨方法。該方法非常適合生物樣品中快速生物學過程的記錄，如細胞內膜系統和細胞骨架的動態學研究、離子成像以及神經放電等等。
不過SIM也有一個明顯的劣勢——只能達到100 nm左右的分辨率。雖然使用非線性SIM成像可以使分辨率媲美其他兩種方法，但代價則是需要使用很強的激發光，失去了活細胞觀察的優勢。
看準了SIM成像的優勢，陳教授團隊便開始著手進行線性SIM方法的優化。為了達到88 nm，188 Hz的優良性能，他們主要在以下幾個方面做出了努力：
1、使用高NA的物鏡，提升極限分辨率，盡可能多的接收光信號
提升成像系統的NA值一直是提高系統分辨率的不二法門。通過使用NA值高達1.7的油鏡，再加上SIM方法本身的2倍分辨率提升，Hessian-SIM系統的最佳分辨率可以達到88 nm。
使用更高數值孔徑的物鏡可以明顯提升光學系統的OTF,使其在傅里葉頻域空間能探測更高頻的信號。在二維的頻域空間中，越靠近中央亮點的區域，代表圖像越低頻的部分，可以看到NA值越高越能覆蓋到邊緣的高頻區域。
同時，NA值越大的物鏡接受光信號的能力也越大，這樣就可以最大限度降低激發光功率，或者使用盡可能短的曝光時間以期達到高速成像的目的。