臺盼蘭染色法
| 實驗方法原理 |
培養的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進行細胞計數。計數結果以每毫升細胞數表示。細胞計數的原理和方法與血細胞計數相同。
在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力，由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。復蘇后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復蘇的效果。
用臺盼蘭染細胞，死細胞著色，活細胞不著色，從而可以區分死細胞與活細胞。利用細胞內某些酶與特定的試劑發生顯色反應，也可測定細胞相對數和相對活力。 |
|---|---|
| 實驗材料 | 細胞懸液 |
| 試劑、試劑盒 | 臺盼蘭 四甲基偶氮唑鹽 酸化異丙醇 |
| 儀器、耗材 | 普通顯微鏡 血球計數板 試管 吸管 酶標儀 分光光度計 |
| 實驗步驟 |
一、細胞計數
1. 將血球計數板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計數板上。
2. 將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數板之間。
3. 靜置3分鐘。
4. 鏡下觀察，計算計數板四大格細胞總數，壓線細胞只計左側和上方的。然后按下式計算：
細胞數/ml=4大格細胞總數/ 4×10 000
注意：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。
二、細胞活力
1. 將細胞懸液以0.5 ml加入試管中。
2. 加入0.5 ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2-3分鐘。
3. 吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。
4. 鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數，計細胞活力。
死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。
活力測定可以和細胞計數合起來進行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。
三、MTT法測細胞相對數和相對活力
活細胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產生蘭色結晶狀甲贊顆粒積于細胞內和細胞周圍。其量與細胞數呈正比，也與細胞活力呈正比。
1. 細胞懸液以1 000 rpm離心10分鐘，棄上清液。
2. 沉淀加入0.5-1 ml MTT，吹打成懸液。
3. 37℃下保溫2小時。
4. 加入4-5 ml酸化異丙醇（定容）。打勻。
5. 1 000 rpm離心，取上清液酶標儀或分光光度計570 nm比色，酸化異丙醇調零點。
注意：MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。
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| 注意事項 |
1.鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。 2.死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。 3.活力測定可以和細胞計數合起來進行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。 4.MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。
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| 其他 |
1、0.4%臺盼蘭染液配制：
臺盼蘭 0.4克 加雙蒸水至100 ml.
2、MTT配制：
MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液或無酚紅的基礎液中，4℃下保存。
3、酸化異丙醇配制：
異丙醇中加入HCl使最終達0.04mol/L。
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