| 實驗方法原理 |
細胞集落形成實驗是檢測培養細胞增殖能力的有效方法之一。由于它是通過檢驗活細胞的增殖能力，因此避免了在生長曲線繪制時將死細胞或不能再分裂細胞計數在內而導致的實驗結果誤差。
細胞集落形成實驗的原理是單個細胞在體外持續增殖6代以上，其后代形成一個細胞群體，稱為集落(colony)。每個克隆均包含50個細胞以上，大小在0.3～1.0 mm之間。通過計算集落形成率(colony forming efficiency)，來測定測試細胞的增殖能力。 |
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| 實驗材料 | Hela細胞 |
| 試劑、試劑盒 | Giemsa染液 胰酶 血清培養液 碘 瓊脂 |
| 儀器、耗材 | 培養皿 細胞計數板 離心機 離心管 CO2培養箱 水浴鍋 |
| 實驗步驟 |
1.平板克隆形成試驗
本法適用于貼壁生長的細胞，包括培養的正常細胞和腫瘤細胞。
(1)對指數生長期細胞，采用常規消化傳代方法，制成細胞懸液。
(2)細胞懸液反復吹打，使細胞充分分散，單個細胞百分率應在95%以上。細胞記數，并用培養基調節細胞濃度，待用。
(3)根據細胞增殖能力，將細胞懸液倍比稀釋。一般按照每皿含50、100、200個細胞的濃度分別接種5ml細胞懸液到培養皿（直徑 60mm ）中，以十字方向輕輕晃動培養皿，使細胞分散均勻。
(4)培養皿置 37℃ 、5% CO2中培養2~3周，中間根據培養液pH變化適時更換新鮮培養液。
(5)當培養皿中出現肉眼可見克隆時，終止培養，棄去培養液，PBS液小心浸洗2次，空氣干燥。甲醇固定15分鐘，棄甲醇后空氣干燥。用Giemsa染液染色10分鐘，流水緩慢洗去染液，空氣干燥。
2.軟瓊脂集落形成試驗
本法適用于非錨著依賴性生長的細胞，如骨髓造血干細胞、腫瘤細胞株、轉化細胞系。利用瓊脂液無粘著性又可凝固的特性，將腫瘤細胞混入瓊脂液中，瓊脂液凝固使腫瘤細胞置于一定位置，瓊脂中腫瘤細胞可能向周圍作全方位的移動，因此可以用來檢測腫瘤細胞的主動移動能力。腫瘤細胞在適宜培養基中又可以增殖，從而可以測定腫瘤細胞克隆形成率。造血系統軟瓊脂集落形成試驗方法相同，主要用于有關細胞分化的研究，但使用培養基不同。
（1）同上（1）~（3）步驟。
（2）調整細胞懸液密度為1x103個/ml細胞。
（3）制備底層瓊脂，完全溶化的5%瓊脂和 37℃ 左右預溫的新鮮完全培養液以1：9比例在 40℃ 均勻混合，加入培養皿（直徑 60mm ）中，每皿含0.5%瓊脂培養基2ml，室溫下瓊脂完全凝固。
（4）制備上層瓊脂,取 37℃ 不同密度梯度(按照每皿含50、100、200個)的細胞懸液1.5ml移入小燒杯中，加入 40℃ 、5%瓊脂等體積混勻，即成0.25%半固體瓊脂培養基。配好的半固體瓊脂培養基立即加入鋪有底層瓊脂的培養皿中，室溫下瓊脂凝固。 37℃ 、5%CO2靜置培養2-3周。
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| 注意事項 |
1. 細胞懸液中單個分散細胞應多于90％。 2. 平板培養早期盡量不要晃動培養皿，以免細胞脫落，導致實驗誤差增加。 3. 平板培養期間應及時更換新鮮培養基，保持培養物獲得充分的營養成分。 4. 軟瓊脂培養時，注意在瓊脂與細胞混合時溫度不要超過40℃，以免燙傷細胞。 5. 接種細胞密度不宜過高。
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| 其他 |
來源《細胞生物學實驗技術》
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