細菌的局限性轉導實驗原理、材料和實驗步驟

一、實驗原理：

轉導是由噬菌體為媒介將一個細胞的遺傳物質轉移給另一個細胞的過程。隨著分子遺傳學的發展，轉導已成為基因精細結構分析的常用方法。轉導可分為局限性轉導和普遍性轉導二大類。
本實驗試圖用局限性轉導為例，用噬菌體（λ）專一性轉導半乳糖發酵基因的現象來說明轉導的基本原理。并初步掌握轉導實驗的基本方法。
用E Coli k12 (λ) gal 作為供體菌，此菌帶有原噬菌體（λ）。控制半乳糖發酵的基因在細菌染色體上和（λ）緊密連鎖。當此菌體受紫外光誘導后，原噬菌體被釋放出來，其中有一定比例的噬菌體帶有鄰近的半乳糖發酵基因。這種噬菌體稱λdg，這種噬菌體在感染另一不能發酵半乳糖的菌體時（即受菌體）就有可能使其轉變成為能發酵半乳糖的菌體。整個過程可以下圖表示：
K12（λ）gal+（供體菌）
↓UV
λgal+
↓
K12 S gal-（受體菌）→ K12 S gal-/ (λ) gal+（轉導子）
上述轉導方式產生轉導子的頻率是很低的，稱低頻轉導。我們選用K12（λ/λgal）雙重溶源菌作供體菌，它經U、V誘導裂解后，可含有大量的帶gal+基因的轉導顆粒，故轉導頻率很高，稱高頻轉導。

二、實驗材料：
大腸桿菌（E Coli）K12（λ）gal+，帶有原噬菌體（λ）和缺陷噬菌體（λdg）能發酵半乳糖，作為供體菌。
K12 S gal-，不帶噬菌體，不能發酵半乳糖，對噬菌體（λ）敏感。作為受體菌及測定噬菌體（λ）效價的指示菌。

三、實驗準備：
1.用具：6cm培養皿 1套
9cm培養皿 6套
1.5ml離心管 5支
離心管 2支
2.培養基
（1） LB液體培養基
（2） 加倍肉湯培養液2ml成分同LB培養液，濃度加倍。
（3） 半乳糖EMB培養基：伊紅（Y）0.4克、美蘭0.06克、半乳糖10克、蛋白胨10克、K2HPO4 2克、蒸餾水、1000ml、pH 7.0-7.2
（4） 磷酸緩沖液：5ml(用1×A)
KH2PO4 1.5g
K2HPO4 9g
蒸餾水 1000ml pH7.0
3.藥品：氯仿0.2ml

四、實驗步驟：
1.噬菌體的誘導和裂解液的制備
第一天：傍晚，從供體菌斜面挑取一環接種于5ml的LB培養液中，37℃培養過夜。
第二天：吸取1ml接種于裝有5ml LB培養液的離心管中，續培養3小時。（另吸取0.1ml，涂一皿，作供體菌對照）
供體菌培養物經3000轉/分離心10分鐘棄去上清液，加4ml磷酸緩沖液制備成菌懸液。
吸取2ml到直徑6cm的培養皿中，經紫外線處理（15瓦。燈距40厘米），打開培養皿蓋子照射20秒鐘后加入加倍濃度的肉湯2ml，在37℃避光培養2-3小時。
用1ml移液槍把上述培養物轉入5ml的離心管中。再加0.2ml氯仿（4-5滴）。劇烈振蕩半分鐘，靜止5分鐘，以4000轉/分離心15分鐘。小心把上清液用無菌滴管轉稱到另一試管，此即噬菌體（λ）的裂解液。
2.受體菌的制備。
第一天：傍晚，從受體菌斜面挑取一環接種于5ml LB培養液中，37℃培養過夜。
第二天：吸取1ml接種于裝有5ml LB培養液的離心管中，繼續培養3小時。
3.轉導實驗（點滴法）：
取倒好的EMB培養基平板2只，在皿底用標記筆按下圖中的樣子畫好取一滿環受體菌，涂出一條菌帶，共涂兩條。37℃培養1.5小時，取出平板，在兩個圓圈和四個方格處，各加一環噬菌體裂解液，培養2天，觀察結果。
4.轉導頻率的測定：
取受體菌0.5ml于離心管中，在37℃預熱數分鐘后，加0.5ml噬菌體裂解液，搖勻，置37℃水浴中保溫15分鐘后，稀釋到10-3，取10-1、10-2和10-3的稀釋液0.1ml在預先倒好的EMB平板上涂布，同時，取受體菌0.1ml涂一皿，作為對照，37℃培養48小時，統計轉導子數目算出轉導頻率。

五、實驗結果：

1.點滴法結果

2.轉導頻率測定