細菌感染性疾病的直接核酸診斷試驗
Florence Paillard, PhD, and Craig S. Hill, PhD
準確和快速的診斷是及時采取治療措施和防止感染性疾病擴散的關鍵。理想的感染性疾病的診斷試劑應該能夠給臨床醫生提供快速、靈敏度高和特異性強的實驗結果。檢測試劑如果靈敏度不高則可能導致疾病的漏檢，使患者不能得到及時的治療，還可造成疾病的擴散；同樣，試劑如果特異性較差則可能出現假陽性結果，假陽性的出現不僅會導致不必要的治療，還可能給人們帶來心理上的陰影。不論對個人還是公共衛生部門，因檢測方法的不可靠所導致的錯誤診斷都有可能造成嚴重的后果。令人欣慰的是，近年來分子診斷技術的發展已使得人們可以研制出比傳統方法更為靈敏、特異和快速的用于感染性疾病的診斷試劑。
一、細菌感染性疾病診斷方法述評
數十年來，檢測細菌的的標準方法是培養（液體和/或固體培養基）和染色，如用于結核分枝桿菌的抗酸染色和淋病奈瑟菌的革蘭染色。其它一些方法還包括采用抗體技術檢測細菌抗原的酶免疫測定（EIA）和直接熒光抗體技術（DFA）等。
采用分子生物學技術檢測微生物核酸成分的核酸檢測（NATs）技術的發展為臨床診斷方法帶來了革命性的變化。目前用于微生物鑒定的NATs主要有兩種類型：培養確認檢測試劑和直接檢測試劑。培養確認的NATs試劑主要用來對培養基上生長的微生物進行確認；直接NATs試劑可以直接檢測標本中的微生物，無需培養。與培養確認探針試劑相比，由于直接NATs試劑完全不需要培養這一步驟，所以可以更快地給出檢測結果；直接NATs試劑一般來說其準確性也高于直接免疫檢測方法。美國FDA批準的第一個非放射性直接NATs試劑是Gen-Probe PACE試劑，用來檢測衣原體和淋球菌感染。
對直接NATs試劑而言，一個至關重要的改進在于加入了目標擴增步驟，即探針檢測前將目標序列進行擴增。第一個用于沙眼衣原體檢測的核酸擴增試劑（NAATs）于1993年獲得了FDA的批準。此后，隨著核酸擴增技術的不斷改進，出現了可以將樣品成分的抑制作用降為最小的第二代NAATs，它的操作流程也得到了相應改進。
本文將就已經商品化并得到FDA批準的用于檢測五種細菌感染的直接NATs試劑進行述評。這五種感染為：鏈球菌性咽炎、肺結核（TB）、陰道炎、衣原體（CT）和淋球菌（GC）感染。
二、直接NAT方法學
非擴增直接NATs（表1）：大多數商品化的直接NATs試劑都采用特異性針對出現在被測生物體內的一段獨有的核酸序列（目標序列）的核酸探針。這種探針通常采用熒光或化學發光標記。所測樣品需進行處理以使其能夠釋放出核酸。檢測時，標記的DNA探針可以和靶序列特異性結合，形成一個穩定的探針-目標序列雜交體。該雜交體被從非雜交探針中分離或區別開后，標記物散發出信號。
在直接檢測臨床標本中的微生物時，NATs可以采用不同的方式來提高試劑的靈敏度。Gen-Probe采用的一項ZL技術是將rRNA作為檢測目標，rRNA在大多數微生物體內是以數以千計的拷貝量存在的。例如，沙眼衣原體中的rRNA可達2000拷貝，而DNA中有用的靶序列在每個細菌體內的量僅有一個或數個拷貝。因此以rRNA為檢測目標可以大大提高試劑的靈敏度。除此之外，Gen-Probe由于在雜交檢測中還采用了雜交保護檢測（HPA）方法，使其試劑的靈敏度得以進一步提高。檢測rRNA和HPA技術的結合使得第一個DNA探針檢測試劑被臨床實驗室廣泛用于培養的確定和直接檢測。
第二個用于提高DNA探針檢測靈敏度的方法是對信號分子進行放大，如雜交捕獲試劑（Hybrid Capture assay）。它采用針對RNA:DNA雜交體的抗體來檢測雜交形成，每個抗體都帶有酶標記物。每個酶分子都會產生多種著色分子用于與之結合的每個雜交分子。這種從一個雜交分子產生多重信號分子的方法稱為“信號放大”方法。但與第三種改進試劑性能的“目標擴增”方法相比，信號放大方法的靈敏度和特異性都要低的多。
目標擴增直接核酸擴增檢測（表1）：目標擴增是指通過在一個試管內產生數百萬個目標序列拷貝的方法來提高試劑的靈敏度，這種方法類似于通過培養使細菌體內產生更多的靶DNA或RNA拷貝以提高檢測的靈敏度。但靶擴增的過程要比培養快的多，它可以用來檢測實驗室里難以培養或不能培養的細菌。目標擴增所采用的復制序列（亦稱amplicons）為標記的DNA探針。目前廣泛采用的鑒定細菌的幾種目標擴增方法分別為PCR、鏈替代擴增（SDA）和轉錄介導擴增（TMA）。
1．PCR：指DNA目標序列受熱變性，然后加入DNA聚合酶進行擴增的過程。可與目標序列特異性結合的引物引導DNA聚合酶對該序列進行復制。DNA合成的每個過程均經歷加熱變性—退火—延伸這樣一個循環，每個循環后拷貝數可增加一倍。由于反應循環可進行一定次數，所以短時間內即可擴增獲得大量目標DNA。
2．SDA：與PCR不同，SDA的擴增過程是在同一溫度下進行的。這種“恒溫”方法也需使用引物來保證擴增的DNA序列的特異性。不同的是，它無需采用加熱變性的方法來解鏈雙鏈DNA，而是采用限制性核酸內切酶對新合成的DNA引物進行切割。DNA聚合酶能識別切割位點并可以在該點重新啟動DNA合成，通過對DNA的復制以替代以前的DNA鏈。這一過程可以使DNA的拷貝成倍增長，并循環進行。和PCR一樣，SDA僅擴增DNA。如果擴增對象是RNA，則需首先將其轉錄為DNA。均相檢測采用出現在SDA反應中的稱之為“分子燈標”的一種特異性熒光探針，這種探針與擴增反應過程產生的復制序列（amplicon）進行雜交并改變其結構時會產生熒光信號。