細菌膜蛋白的分離

實驗概要

本實驗對細菌膜蛋白進行了分離。

主要試劑

1. Tris-Mg 緩沖液
   10mM Tris-Cl
   5mM MgCl₂
   pH 7.3，4℃保存
2. 2%(w/v)十二烷基肌氨酸鈉 (SLS)

實驗步驟

1. 于20ml 營養肉湯中過夜培養細菌，37℃，200rpm。
2. 10000g、20min、4℃離心，去上清。
3. 20ml預冷的Tris-Mg緩沖液重懸，同樣條件離心，再重懸于預冷的Tris-Mg緩沖液。
4. 超聲波破碎細菌。
5. 3000g，10min室溫下離心去除未破碎細菌。小心吸取上清（含有胞質成分和細菌外被成分）。
6. 超速離心I：100,000g，60min，4℃，去除上清（胞質成分），收集細菌外被成分。
7. 用10ml含2％的SLS的Tris-Mg 緩沖液重懸沉淀物，室溫溫育20-30min。
8. 超速離心II：70,000g，60min，室溫沉淀收集外膜蛋白，去除上清（含細胞質膜）。重復7、8兩步。
9. 充分吸除上清，并根據沉淀體積大小用0.1-0.2 ml的ddH₂O重懸沉淀物。根據公式：蛋白濃度(mg/ml)=1.450 D₂₈₀-0.740 D₂₆₀測定外膜蛋白濃度，調節蛋白濃度至40ug/ul，該蛋白質樣品-70℃貯存。