細菌鞭毛纖細，直徑只有10～30nm，遠低于光學顯微鏡的分辨率，只有采用特殊的染色方法才能在普通光學顯微鏡下觀察其形態。由于細菌鞭毛染色在細菌鑒定中起著很重要的作用，故以下將對其方法及其應用進展作一論述。
一、細菌鞭毛染色方法
目前，細菌鞭毛染色方法根據染色劑的不同，可分為堿性復紅法、副品紅法、結晶紫法、維多利亞藍B法、鍍銀染色法和熒光蛋白染色法6類，前5類方法的媒染劑成分中均含有單寧酸，染色原理通常是采用不穩定的膠體溶液做媒染劑，并使其沉淀于鞭毛上而使“鞭毛腫脹（tar and feather）”，鞭毛直徑加粗，進一步染色后即可在油鏡下觀察。
1. 堿性復紅法和副品紅法：
1926年由Gray首創堿性復紅法，其媒染液成分包括20%丹寧酸水溶液2.0ml，硫酸鉀鋁飽和水溶液5ml，飽和氯化汞水溶液2ml，3%堿性復紅乙醇（95%）溶液0.4ml，臨用前混合，且需過濾后方可使用。染片時，媒染劑染色約6min，具體時間尚需在試驗中摸索確定，染色液是抗酸染色Ziehl-Neelsen石碳酸復紅染液，染片時需要1小片吸水紙蓋在涂片上，染色3min。由于該方法媒染劑混合物不穩定、操作復雜、經驗性強。Leifson于1930年建立了副品紅法，并于1938年和1951年兩次對該方法進行了改良，稱為Leifson方法。染色試劑由3種溶液組成：A為1.5%NaCl水溶液，B為3%單寧酸水溶液，C為乙酸副品紅0.9g，堿性副品紅0.3g溶解于100ml95%乙醇溶液中。使用時把等體積A和B混合，然后再加2體積C與之相混。該試劑冷藏可保存1～2個月。
盡管Leifson方法的試劑可以冷藏保存1～2個月，比Gray法進步了，但Gray法、Leifson法仍存在試劑穩定性較差的問題；并且制備涂片程序亦繁鎖，如細菌要接種營養瓊脂斜面，制備涂片前要用蛋白胨水懸浮培養物斜面0.5 h，然后用該菌懸液化氣制涂片；缺乏對染色效果方法的評價。
1976年，Clark在Leifson法的基礎上，通過大量試驗解決了3個重要問題：首先，制備涂片時可以直接從Columbia瓊脂血平板上取菌制備；；其二，可運用打分的方法進行染色效果評價；；其三，首次證明了血平板培養和肉湯培養的細菌鞭毛染色效果無差別。未使用Leifson法中的副品紅染色劑，而使用了Gray法中的堿性復紅染色劑。
具體配方：1.2%堿性復紅，1.5%單寧酸和0.75%NaCl，95%乙醇溶解堿性復紅后，過夜使用。用1 mol/L NaOH溶液調pH至5，染液需4℃保存，穩定1個月。
Clark雖然使用了3分制評分標準評價染色效果，但由于沒有解決染色液的穩定性差的問題，仍不夠完善。1981年Forbes在前人的基礎上對堿性復紅法進一步改良其配方：0.4g堿性復紅，0.2g單寧酸和0.5g硫酸氨鋁，裝于16 mm×125 mm的試管中，密閉保存。染色前，用2 ml 95%乙醇，0.5ml甘油，7.5ml Tris緩沖液混合物使其溶解，充分搖動3～5min，2500r/min離心2min，室溫反應30min后使用。試管中的混合液加入礦物油后，室溫下能保存2周。Gray法、Leifson法及Clark法的染色時間均需要試驗摸索，Clark改良法的時間為5～15min，Forbes法則只需1min，但Forbes法對于腸桿菌科的染色效果不理想，除了變形桿菌，評分值都在3分以下。Forbes仍未解決染色試劑穩定性差的問題。
2. 結晶紫法：
又稱Ryu法，1937年由Ryu建立，1982年由Kodaka等進行了改良。媒染劑：5%石碳酸10 ml，2g單寧酸和10 ml飽和硫酸鉀鋁。染色劑：飽和結晶紫乙醇溶液，即12g結晶紫溶于100 ml無水乙醇中。使用時把10份媒染劑與1份染色劑混合，染色5min。1989年，Heimbrook等使用改良的Ryu染色試劑，采用濕片技術進行鞭毛染色，雖然可以觀察到細菌鞭毛，但效果不好。Ryu染色方法優點是試劑比較穩定，目前Difco公司已經研制出該方法的商品試劑盒，但染色效果亦不甚理想，至今尚無一篇文獻對其方法進行評分評。
3. 維多利亞藍B法：
1990年由Inoue等報道日本制藥株式會社Shionogi Seiyaku研制出一種細菌鞭毛染色商品試劑盒。其試劑組成包括維多利亞藍B、苯酚、單寧酸和硫酸鉀鋁，染色約需7min。該試劑保存期約為6個月，關于其染色效果雖然有過一篇文獻評述，但卻沒有采用評分法進行評價，很難判斷其染色效果。
4. 鍍銀染色法：
1958年Rhodes根據Fontana的螺旋體改良鍍銀染色法，建立了一種細菌鞭毛鍍銀染色法。試劑分為媒染劑和銀染劑。
媒染液：10%單寧酸10 ml加5 ml飽和硫酸鉀鋁水溶液，再加1 ml苯胺飽和水溶液形成沉淀，通過搖動又能重新溶解，加入5%FeCl3水溶液1 ml形成黑色溶液，穩定10 min后使用。
銀染液：配制5%AgNo3水溶液100 ml取出10 ml備用，再緩慢加入濃氨水（比重0.880）使形成的沉淀剛好重新溶解，最后把備用的10 mlAgNo3溶液向其中逐滴加入，直到搖動后呈現輕微而穩定的薄霧狀溶液為止，避光保存，可穩定數周。
用媒染液染片3～5min，蒸餾水充分洗滌后，再把銀染液滴加至涂片上。加熱至接近沸騰，染色3～5min。由于Rhodes鍍銀染色法媒染液成分復雜、操作繁鎖，所以1965年Blenden等改良了細菌鞭毛鍍銀染色法的配方。試劑A：100 ml蒸餾水中加入5 g單寧酸，1.5 gFeCl3，15%福爾馬林2 ml，1%NaOH溶液1 ml。試劑B：使用2% AgNo3，其他同于Rhodes，但試劑不穩定，要求在4h內使用，并用要用氨水調pH至10。試劑A染片2～4min，試劑B染色30 s，不需加熱。由于以上兩種鍍銀染色方法都要使用營養瓊脂斜面培養物，并且需用無菌蒸餾水懸浮菌液制片，未采用評分法評價鍍銀染色方法。因此1977年，West等對鍍銀染色法進一步改良，制備涂片時直接使用血平板，評價染色效果首次使用5分制，通過該評價方法證明了加熱銀染液染片可以提高染色效果。
試劑配方：媒染液為飽和硫酸鉀鋁水溶液25 ml，10%單寧酸50 ml，5%FeCl3水溶液5 ml，5℃保存，染色液配制同Rhodes，但需避光5℃保存。
媒染液染片4min，銀染液滴加至涂片上加熱至微冒蒸汽，染色4min。同時West等還對使用不同培養基進行染色效果評價，包括半固體動力培養基、血瓊脂平板、TSA（trypticase soy agar）斜面，其中半固體動力培養基和TSA斜面25℃，培養18～24h；血瓊脂平板35～37℃，培養18～24h。評價結果血瓊脂平板35～37℃，培養18～24h不適于細菌鞭毛染色，而半固體動力培養基和TSA斜面25℃，培養18～24h適合于細菌鞭毛染色，同時也證明了使用福爾馬林處理標本制備涂片并不能有效阻止鞭毛脫落。由于鍍銀染色法媒染液不穩定，需避光5℃保存，1992年Porter等繼續改良該方法，其試劑配方同West等的方法，只是媒染劑避光室溫可保存數月，延長媒染劑染色時間為8 min，染色液不需加熱，只染30 s，制備涂片程序略有不同。使用TSA平板，36℃培養24h，但遺憾的是Porter等只使用了1種細菌（奇異變形桿菌）進行研究。于是1994年Finegan等進一步證實使用過期媒染劑進行鍍銀染色可以增強鞭毛染色效果，并使用4種細菌（綠膿假單胞、奇異變形桿菌、黏質沙雷菌、枯草芽孢桿菌），用trypitcase soy肉湯及其瓊脂平板，26℃培養24h。試劑配方仍不變，媒染液放置1、2、4、8、16周后進行染色，媒染液染色8 min，銀染液染色30～60 s，不需加熱。這4種細菌均染色成功，從而證明媒染液可至少放置16周。
2002年谷海瀛發明了一種新的細菌鞭毛鍍銀染色法。該法將媒染劑分為A、B兩種。A液為酸化FeCl3溶液，B液為15%單寧酸，含甲醛1 ml，用時A、B液等量混合，輕微加熱，染片40s，再用銀染液涂片加熱至微冒蒸汽，染色10 s。通過對19個屬，34個種，228株細菌進行鞭毛染色，應用West等的染色效果評價方法進行評價。血瓊脂平板培養平均每株菌獲得4.7分，肉湯培養平均每株菌獲得4.6分，其中100株非發酵菌在血平板培養獲得滿分5分。重要的是這種方法不僅染色效果好，而且解決了試劑穩定性差的問題，此種試劑常溫下至少可保存1年。
5. 熒光蛋白染色法：
2000年，Grossart等報道了一種熒光蛋白染色法該方法是在玻片上加10μl活細菌液體培養物，再加0.5μl熒光染色劑（nanoOrange），然后加30%聚乙烯吡咯烷酮10～20μl，蓋上蓋玻片，10～15min后使用放大倍數×1250，激發波長490nm，發射波長520 nm的落射熒光顯微鏡（epifluores cence microscopy）觀察。研究中共檢測了37株細菌，其中有動力的6株細菌未觀察到鞭毛。這種新方法不適合于在臨床微生物實驗室常規開展，因為結果觀察時必須借助特定的設備，細菌培養必須使用液體培養基，其可靠性還有待進一步驗證。
綜上所述，無論是堿性復紅法、副品紅法、結晶紫法、維多利亞藍B法，還是傳統鍍銀染色法都無法克服試劑不穩定這一最大的缺點。結晶紫法雖然試劑比較穩定，但染色效果卻不理想。谷海瀛發明的細菌鞭毛鍍銀染色法操作簡便、快速、試劑穩定、重復性好，可以作為實驗室常規鞭毛染色方法推廣應用。
二、細菌鞭毛染色應用意義
細菌鞭毛是細菌的運動器官，幽門螺桿菌能夠從強酸性的胃內腔穿過胃上皮細胞上的黏液層達到胃上皮細胞的中性環境，這就是鞭毛運動作用的很好例證。
細菌分類學常將細菌的動力測定作為鑒定細菌的重要試驗，動力試驗常用懸滴法、壓滴法和半固體培養基法。但對于弱動力菌株懸滴法和壓滴法的觀察結果常為陰性，而使用半固體培養法可以得到陽性結果，谷海瀛發現，使用MTT半固體培養基更容易觀察菌株的弱動力，但至少要培養72h才能觀察到。Rhodes等已論述每株細菌每一菌體細胞上的鞭毛數量是不恒定的，同一株菌可以觀察到甚至5種以上不同鞭毛數的菌體細胞，例如大腸埃希菌在鞭毛涂片染色后，可以發現菌體鞭毛數量1～10根，由于菌體細胞的鞭毛數量的多樣化，可以看到多種鞭毛分布的菌體細胞，這種現象可能是與鞭毛基因表達有關，也可能與鞭毛脫落有關。
通過鞭毛染色，可以觀察到鞭毛形態、數量和鞭毛在菌體分布的位置，鞭毛數量和在菌體上的分布位置是鑒定細菌的重要依據之一，根據鞭毛的這些特征，可將有動力細菌分為單端極鞭毛菌、單端叢鞭毛菌、周鞭毛菌、側鞭毛菌。
單端極鞭毛（monotrichous）：在菌體的一端只有1根鞭毛，例如綠膿假單胞，但這個概念可能要改變，敏捷食酸菌（acidovorax facillis，曾稱敏捷假單胞）、德氏食酸菌（acidovorax delafieldii，曾稱德氏假單胞）、缺陷短波單胞菌（brevundimonas diminuta，曾稱微小假單胞）、泡囊短波單胞（brevundimonas vesicularis，曾稱泡囊假單胞）、棲稻假單胞（pseudomonas oryzihabitans）、腐敗希瓦菌（shewanella putrefaciens，曾稱腐敗假單胞）。這些菌曾均被描述為單端極鞭毛菌現在證明這些菌均為一端有1～2根鞭毛，現可以重新定義這是單端雙毛菌（bitrichous）。
叢鞭毛（lophotrichous flagella 或 multitrichous flagella）菌體細胞的一端或兩端鞭毛數大于2，例如惡臭假單胞菌。
周鞭毛：鞭毛多少有些均勻分布于菌體細胞表面外周，由于文獻沒有定義鞭毛數，可以提出新的定義，如果菌體細胞鞭毛數多于3，且幾乎均勻分布于該細胞表面，即為周鞭毛，例如腸桿菌科細菌。
側鞭毛：分為單側鞭毛（lateral flagellum）和多側鞭毛（lateral flagella），單側鞭毛就是菌體細胞側邊長有1根鞭毛，谷海瀛首次發現非O1型霍亂弧菌有單側鞭毛。國內外文獻提到的側鞭毛（lateral flagella）系指多側鞭毛，即菌體細胞側邊分布的多根鞭毛，形態上側鞭毛和周鞭毛難以區分。9版伯杰手冊在革蘭陰性需氧桿菌、微需氧桿菌和球菌Group4的章節中，將Subgroup 4a 80個菌屬進行列表，把有鞭毛的細菌分為兩類，即單端鞭毛菌和側鞭毛菌。
例如，產堿桿菌屬和土壤桿菌屬等在此列表中為側鞭毛，但在該手冊的菌屬特征描述中卻為周鞭毛，Tison也認為一些弧菌在固體培養基上能夠爬動（swarm），鞭毛染色為周鞭毛，這是周鞭毛和側鞭毛在概念上的混淆。為了區別這兩個概念，本研究將側鞭毛定義為在液體培養時染色表現為單端鞭毛（圖5），而在固體培養上可表現為周鞭毛，這種雙相性的周鞭毛應稱為側鞭毛，例如副溶血弧菌在液體培養時，為單端極鞭毛，固體培養時可見周鞭毛（圖6），曾被認為是周鞭毛實際應為側鞭毛。Shimada等發現嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌22℃固體培養可以顯示周鞭毛，但肉湯培養卻是單端極鞭毛。Inoue等發現類志賀鄰單胞菌25℃固體培養可以顯示周鞭毛，但肉湯培養卻單端叢鞭毛，谷海瀛也證實這些發現，根據上述側鞭毛定義，這些周鞭毛均應是側鞭毛。Kirov等的研究也證實了這一觀點。
通常細菌培養溫度和鞭毛生長溫度是一致的，但也有例外，鞭毛生長溫度應該根據測定細菌動力的最適溫度來確定，有些細菌需要在室溫下（20～25℃）培養進行鞭毛染色，例如耶爾森菌屬。有文獻描述李斯特菌的動力溫度是20～22℃，這也是鞭毛的生長溫度。谷海瀛發現，單核李斯特菌在35℃培養，進行鞭毛染色，效果也很好。
細菌鞭毛的主要生理作用是動力，在液體培養中表現為“泳動”（swimming motility），而在固體培養基表面表現為“爬動”（swarming motility），有些細菌如變形桿菌就可以爬動側鞭毛菌也有這種特性，這對于鑒定細菌很有幫助。
在檢測某些細菌的鞭毛抗原時，如果該菌株有動力，用血瓊脂平板培養的細菌鞭毛染色未見鞭毛或者發現鞭毛脫落，再使用血平板培養的菌落做血清凝集試驗，出現陰性結果，這種情況下應該使用肉湯培養物做血清凝集試驗，亦可用誘導方法恢復。
利用細菌鞭毛染色技術，可以將有動力的細菌進行歸類，特別是在細菌鑒定中具有否定作用。例如，某一菌株經鞭毛染色確定為單端極鞭毛菌，盡管這株菌氧化酶試驗陰性，發酵葡萄糖，但也絕不能把它歸為腸桿菌科細菌進行鑒定。又如某一非發酵菌株，產生水溶性熒光色素，鞭毛染色為叢鞭毛，但它絕不對綠膿假單胞菌。因此，為了更準確地鑒定細菌，細菌鞭毛染色方法應該作為常規技術在臨床實驗室廣泛應用。