三糖鐵試驗通過測試細菌發酵糖以及產生H2S的能力，對其進行初步鑒定。細看三糖鐵的配方，其中含有三種糖：乳糖、蔗糖和葡萄糖，而且葡萄糖的含量為0.1%，是乳糖、蔗糖含量的十分之一。事實上，用三糖鐵瓊脂進行糖發酵試驗的巧妙之處，就是在于葡萄糖的含量、葡萄糖/乳糖（蔗糖）的比例，以及與18-24h培養時間的配合。
三糖鐵試驗中葡萄糖的發酵有兩種途徑，一是在培養基斜面上進行的有氧代謝。葡萄糖發酵后的中間產物丙酮酸，在有氧的條件下，通過三羧酸循環完全分解，產生CO2、水。
另一種是在三糖鐵底層進行的無氧代謝。葡萄糖在厭氧的條件下，通過EMP途徑分解為丙酮酸，丙酮酸再進一步分解產生各種穩定的終產物：乳酸等有機酸、醛、醇、CO2、H2。
三糖鐵培養基中所用的酸堿指示劑是酚紅，其在酸性條件下（pH<6）顯黃色，在堿性條件下（ph>8.4）顯紅色。對于不發酵乳糖、蔗糖的沙門氏菌，培養開始后細菌先利用低含量的葡萄糖產生丙酮酸，斜面變為黃色。在有氧的條件下，丙酮酸繼續分解為CO2和水。培養后18-24h，三糖鐵斜面中低含量（0.1%）的葡萄糖已完全分解為CO2和水，細菌開始以培養基中的蛋白胨作為營養，分解蛋白胨產氨，培養基斜面中的酚紅指示劑，顯示為紅色的堿性反應。
培養后18-24h，在三糖鐵的底層，葡萄糖在厭氧的條件下分解形成有機酸，一些有機酸繼續分解為CO2和H2 ，但在培養基底層中仍有部分有機酸存在，導致酚紅指示劑顯示為黃色的酸性反應（見圖1）。
對于發酵葡萄糖和乳糖的大腸埃希氏菌、雙相亞利桑那菌，以及發酵葡萄糖和蔗糖的普通變形桿菌。培養后18-24h，三糖鐵斜面中較高含量的乳糖（蔗糖），還沒有完全分解，中間產物丙酮酸仍然存在,此時培養基斜面中的酚紅指示劑，顯示為黃色的酸性反應。而在三糖鐵的底層，乳糖（蔗糖）在厭氧的條件下分解形成大量有機酸，培養基底層中的酚紅指示劑，也顯示為黃色的酸性反應（見圖2）。
對于乳糖、蔗糖和葡萄糖都不發酵的糞產堿桿菌，由于不能利用三糖鐵中的糖，細菌是以培養基中的蛋白胨為營養，分解蛋白胨產氨，導致培養基斜面和底層中的酚紅指示劑，均顯示為紅色的堿性反應（見圖3）。在三糖鐵瓊脂上只有出現這種反應時，才可確定待測菌為非沙門氏菌。
三糖鐵配方中的硫代硫酸鈉和硫酸亞鐵銨，是檢測H2S的指示劑。一些細菌在酸性的條件，將硫代硫酸鈉還原并產生H2S，H2S與硫酸亞鐵銨中的鐵離子形成黑色的硫化亞鐵沉淀（見圖4）。
操作步驟及要點
1、準備三糖鐵瓊脂時，斜面的長度與底層的高度最好一致。為了產生良好的厭氧環境，底層的高度應不小于3 cm.
2、待測菌宜來自沙門氏菌選擇性培養基上可疑菌落，其他來源的未知菌應確保是觸酶陽性的革蘭氏陰性菌，另外還應進行氧化酶試驗，以區分氧化酶陽性的非發酵菌。
3、從待測菌菌落的中心部位挑取菌苔，以免混入雜菌。在實際檢測工作中，有時候發現在沙門氏菌選擇性培養基上菌落非常典型，但其三糖鐵試驗的結果卻難以解釋。出現這種情況時，應考慮是否存在接種的菌株不純的問題。為避免混入雜菌，也可將選擇性培養基上可疑菌落進行純培養后，再挑單個菌落進行測試。
4、用接種針進行接種，切記不要用接種環，否則會插裂瓊脂破壞厭氧環境，并可能導致誤判產氣結果。
5、通常的接種順序，是先在斜面劃線，再于底層穿刺。筆者覺得最好先穿刺底層，再于斜面劃線，這樣可以防止在培養基底層漏種細菌。其實只要穿刺并確保斜面及底層都接種了細菌，斜面的劃線接種已顯得不是辣么鐵別重要了。
6、接種完成后，不要將試管帽旋緊或試管塞塞緊，以免影響斜面氧氣的供應和葡萄糖的有氧代謝。
7、將完成接種的三糖鐵瓊脂，置于36℃培養18-24h。
結果觀察
糖發酵的結果觀察
糖發酵的結果是通過培養基的顏色變化來觀察。三糖鐵試驗的培養時間是18-24h，應在這個時間范圍內觀察的結果，不能提早也不要延遲。
這是因為，對于只發酵葡萄糖的細菌，如果過早觀察結果（比如培養后12h或更早），此時斜面中少量的葡萄糖尚未分解完全，存在中間產物丙酮酸導致斜面呈現黃色的酸性反應，以致錯誤地判斷該菌發酵乳糖（蔗糖）。如果延遲觀察結果（比如培養后48h以上），此時底層的葡萄糖也完全分解了，細菌開始分解蛋白胨產氨，底層和斜面都出現紅色的堿性反應，以致錯誤地判斷該菌對三種糖均不發酵。
很多時候由于H2S的大量產生，三糖鐵瓊脂底層全部變黑，無法觀察底層糖發酵的結果（見圖4）。因此，有檢驗員在培養基底層接種時，不把接種針穿刺至試管底部，而是留出一段底層不接種細菌，以便于糖發酵結果的觀察。其實出現三糖鐵瓊脂底層全部變黑時，可直接判斷為底層產酸。因為有研究表明，在三糖鐵瓊脂上產H2S的細菌，同時也發酵糖產酸產氣。所以各位親，不要怕黑，還是一針到底吧。
另外小聲講一句，培養時將三糖鐵瓊脂的試管塞旋松，還可以減緩H2S的過量產生哈。這個小秘訣，一般人我不告訴他！嘿嘿~
需要提醒的是，當培養基的斜面和底層都出現紅色堿性反應，并確定待測菌為非沙門氏菌時，應仔細檢查穿刺線和斜面的劃線，觀察是否有細菌生長的跡象，以排除漏種細菌的情況。
對觀察的結果應及時進行記錄，可將培養后的三糖鐵瓊脂置冰箱冷藏不超過四天，但不能用冷藏后的三糖鐵瓊脂，再次進行結果的判讀。
02
產H2S結果觀察
當三糖鐵瓊脂出現黑色沉淀，黑色沉淀蔓延至整個底層并掩蓋酸性反應，甚至斜面上也出現少量黑色沉淀；或者黑色沉淀蔓延底層并沒有掩蓋酸性反應；或者在底層的頂部出現一圈黑色環時，均判斷為產H2S。
還要說明的是，一些在克氏雙糖鐵瓊脂上產H2S的菌株，在三糖鐵瓊脂上卻不產H2S，這可能是蔗糖抑制了還原硫代硫酸鈉的酶。另外，也不是所有H2S陽性的沙門氏菌，在三糖鐵瓊脂上都產H2S。
03
產氣的結果觀察
首先需要指出的是，產氣是指產CO2和H2，并不是指產H2S。當培養基中出現以下現象之一，可判斷為產氣：培養基內有單個或多個氣泡；培養基開裂；培養基從試管底部全部上移，在試管底出現空腔；在試管的一側，培養基出現缺口或凹陷（見圖2）。
結果記錄
三糖鐵試驗的結果記錄，宜用規范的方式，常見的套路是先描述斜面的反應，再描述底層的反應，中間用斜杠隔開。例如，腸炎沙門氏菌三糖鐵試驗的典型反應為，斜面產堿，底層產酸產氣，產H2S。其結果可按如下方式記錄：
K/?，H2S
注：K代表產堿，A代表產酸，○代表產氣，H2S代表產硫化氫。