美希索中克隆培養

Noble瓊脂 Difco 胎牛血清 1.6%美希索

兩倍濃度培養基 生長培養基 無菌超純水 無菌錐形瓶 吸管 通用容器 培養皿 水浴 三角瓶 托盤 電子細胞計數儀 本生煤氣噴燈

1. 按照 14.4 實驗中步驟 1~7 制備瓊脂凝膠底層。

2. 用等體積 2× 培養基（即 Ham’SF12、RPMI1640、DMEM 或 CMRL1066。用 10×培養基配2× 培養基，取半量所需終液量，加兩倍濃度的血清）稀釋美希索（1.6 %美希索，4 Pa-S(4000cps)，以 UPW 溶解，置于冰上）至 0.8 % ，充分混勻，冰上保存。

3. 胰蛋白酶消化單層貼壁細胞，收集懸浮細胞或骨髓細胞，計數。

4. 制備以下稀釋濃度的細胞，細胞的最高濃度為 1×10⁵ /ml 。

(a)1×10⁵ /ml

(b)將 1×10⁵ /ml 稀釋 3 倍成 3.3×10⁴ /ml

(c)將 3.3×10⁴ /ml 稀釋 3 倍成 1.1×10⁴ /ml

(d)將 1.1×10⁴ /ml 稀釋 3 倍成 3.7×10³ /ml

美希索有黏性，用不帶針頭的注射器更容易操作。

5. 將四種稀釋度分別標在 4 個小玻璃瓶或試管上，從每種稀釋液中吸出 40 μl，包括 1×10⁵ /ml 稀釋液，分別放人相應容器內，再向每個容器中加 4 ml 0.8 % 美希索培養基，用漩渦混旋器充分混勻，如果細胞特別脆弱，用注射器（用于分裝美希索。由于黏稠，美希索會附著于吸管內壁，造成分裝量不準確）上下輕柔地抽吸溶液幾次，然后用注射器再從每個容器中吸出 3 個 1 ml 分別加在相應的三個培養皿上。最終濃度如下：



(a) 1×10⁵ /ml/皿

(b) 330 /ml/皿

(c) 110 /ml/皿

(d) 37 /ml/皿

6. 將培養皿放置在加濕的溫箱屮培養至集落形成。由于集落會在瓊脂與美希索的界面形成，所以培養 1 周后添加新鮮培養基 1ml/皿或孔，2 周后在不影響集落的情況下，棄舊液，更換更多新鮮培養基。