考馬斯亮藍G250法測定蛋白質含量的原理是什么

在酸性條件下，考馬斯亮蘭G-250染料與蛋白質疏水區結合，導致最大吸收峰由465 nm 變為595 nm，同時顏色也由棕色變為藍色,該藍色化合物顏色的深淺與蛋白質濃度的高低成正比關系。將蛋白質樣品或稀釋的BSA 與Bradford試劑混合，測量在595 nm處的吸收值，在建立由一系列稀釋的BSA建立的標準曲線的情況下，蛋白質的濃度可以根據標準曲線而確定。

考馬斯亮藍G-250（Coomassie brilliant blue G-250）測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種。在游離狀態下呈紅色，最大光吸收在488nm；當它與蛋白質結合后變為青色，蛋白質-色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比，因此可用于蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右的時間內達到平衡，完成反應十分迅速；其結合物在室溫下1h內保持穩定。

該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質含量，測定蛋白質濃度范圍為0～1 000μg/mL，最小可測2.5μg/mL蛋白質，是一種常用的微量蛋白質快速測定方法。

考馬斯亮藍有G250和R250兩種。其中考馬斯亮藍G250由于與蛋白質的結合反應十分迅速，常用來作為蛋白質含量的測定。考馬斯亮藍R250與蛋白質反應雖然比較緩慢，但是可以被洗脫下去，所以可以用來對電泳條帶染色。

考馬斯亮藍法測定蛋白質含量流程：

該方法用于大多數蛋白質的定量是比較精確的，但不適用于小分子堿性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過0．2%影響測定結果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。

1．Bradford濃染液的配制：將100mg考馬斯亮藍G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸餾水補充至1000ml，此染液放4℃至少6個月保持穩定。

2．標準曲線蛋白質樣本的準備：盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標準品，例如測定抗體，可用純化的抗體作為標準。如果待測樣本是未知的，也可用抗體作為標準蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標準曲線。

3．將待測樣本溶于緩沖溶液中，該緩沖溶液應與制作標準曲線的緩沖溶液相同(最好用PBS)。

4．按1：5用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液，如出現沉淀，過濾除去。

5．每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液，作用5～30min。染液與蛋白質結合后，將由紅色變為藍色，在595nm波長下測定其吸光度。注意，顯色反應不得超過30min．

6．根據標準曲線計算待測樣本的濃度。