耐熱大腸桿菌群系需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌，在 44.5℃培養 24h—48h 能發酵乳糖產酸并產氣。 該菌主要來自人和溫血動物糞便，可作為糞便污染指標來評價化妝品的衛生質量, 推斷化妝品中有否污染腸道致病菌的可能。
操作步驟如下：
1. 取 10mL 1：10 稀釋的檢液，加到 10mL 雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養基中，置 44.5℃±0.5℃培養箱中培養 24h，如既不產酸也不產氣，繼續培養至 48h，如仍既不產酸也不產氣，則報告為耐熱大腸菌群陰性。
2. 如產酸產氣，劃線接種到伊紅美藍瓊脂平板上，置36℃±1℃培養18h—24h。同時取該培養液 1—2 滴接種到蛋白胨水中，置 44.5℃±0.5℃培養 24h±2h。 經培養后，在上述平板上觀察有無典型菌落生長。耐熱大腸菌群在伊紅美藍瓊脂培養基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紫色，中心較深的菌落，亦常為耐熱大腸菌群，應注意挑選。
3. 挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。
4. 在蛋白胨水培養液中，加入靛基質試劑約 0.5mL，觀察靛基質反應。陽性者液面呈玫瑰紅色；陰性反應液面呈試劑本色。
檢驗結果報告
根據發酵乳糖產酸產氣，平板上有典型菌落，并經證實為革蘭氏陰性短桿菌，靛基質試驗陽性，則可報告被檢樣品中檢出耐熱大腸菌群。