耐熱DNA聚合酶特點:
合理選擇耐熱DNA聚合酶是PCR成敗與否的一個關鍵因素,如何選擇最合適的耐熱聚合酶,是進行PCR實驗首先要考慮的問題。目前市面上有許多耐熱DNA聚合酶,雖然名稱各不相同,但主要區別在于特異性、保真性、耐熱性、擴增速率、擴增片段長度等幾個指標。
TIANGEN公司生產的耐熱DNA聚合酶全部采用標準化生產工藝和質量檢測標準,是經過多次分子篩、離子交換層析柱純化的超純型產品,去除了宿主DNA和蛋白酶等雜質因素的影響,特異性非常好,而且特別穩定,經檢測,室溫放置1個月,活性不變或改變甚微。
不同耐熱聚合酶的比較:
Taq:擴增效率最高的耐熱DNA聚合酶,能很好的擴增6kb以下的DNA片段。擴增堿基出錯率為10-5左右。
Pfu:目前保真度最高的耐熱DNA聚合酶,堿基出錯率為10-6,但擴增效率低于Taq酶,一般能很好的擴增2kb以下的片段。
Taq Plus:即擴增效率高和保真度好于一身。擴增效率比Pfu高,保真度比Taq好。能有效的擴增10kb以下的片段。
Hotstart Taq:經過化學修飾的耐熱DNA聚合酶。此酶在常溫下,活性被化學基團封閉,要在94-95℃加熱數分鐘才能回復正常活力開始反應,避免了起始循環較低溫度下的非特異性擴增,提高了反應的靈敏度和特異性。
Long Taq :具有3’-5’外切酶活性的耐熱DNA聚合酶,它不但擴增效率高而且錯配率低,對于簡單模板可擴增長達40kb的模板,對復雜模板也可擴增長達15kb的片段。
Taq Platinum:熱啟動高保真耐熱DNA聚合酶。如果對保真度要求很高,而用Pfu擴增有難度,可選用Taq Platinum,一般擴增長度可達4kb。
不同實驗對酶的選擇:
1.克隆普通長度的目的DNA片段(可選產品:Taq、Taq Plus)
2.保真度要求較高,片段比較短,如點突變、基因篩選等(可選產品:Pfu、Taq Platinum)
3.高保真長片段擴增,如構建基因圖譜及分子遺傳學研究等(可選產品:Long Taq、Taq Plus)
4.擴增基因組模板,需要降低背景(可選產品:Hotstart Taq、Taq Platinum)
5.擴增GC含量較高或二級結構較復雜的模板(可選產品:Taq Plus、Long Taq、Taq Platinum)
6.實時熒光定量PCR反應(可選產品:Taq、Hotstart Taq、Taq Platinum)
7.從菌株或質粒模板,篩選鑒定目的克隆,擴增6kb以下的片段(可選產品:Taq、Taq Plus、2×Taq PCR MasterMix)
8.模板比較復雜或目的片段豐度低,用普通Taq酶擴增不出條帶(可選產品:2×Taq PCR MasterMix、2×Pfu PCR MasterMix)