耐藥質粒DNA的轉化

實驗概要

本實驗介紹了將質粒DNA分子轉入大腸桿菌的方法及如何篩選帶有質粒DNA的細胞克隆，即轉化子。

實驗原理

受體菌Ecoli RRI  在低溫條件下經Ca   處理，可改變細胞膜的通透性，利于受體菌對DNA的攝取，這種經Ca   處理的細菌稱感受態菌。pBR322  質粒帶有氨基芐青霉素（Ap）和四環素（Tc）基因，如將pBR322質粒轉入到對上述抗生素敏感的Ecoli  RRI菌體內，則可使該細菌獲得Apr和Tcr，表現出對Ap和Tc的抗藥性。

主要試劑

1．LB 液體培養基
2．75mM CaCl₂

3．氨芐青霉素瓊脂平板（50ug/ml）

主要設備

1．滅菌小試管

2. 刻度吸管

3. 微量加樣器

4. 離心機

5. L形玻璃棒

實驗材料

1．菌株 E.coli RRI

2．pBR322 質粒DNA,
3．感受態菌75mmol CaCl₂

實驗步驟

1. 感受態菌的制備

   1) 將細菌接種于5ml LB液體培養基中，37℃振蕩培養16~20h。
   2) 取新鮮菌液，按1/100的接種量接種于LB培養基中，37℃振蕩培養2~3h。
   3) 取1.5ml菌液，4℃ 3000rpm/min,離心5min，棄上清。
   4) 菌體沉淀加入750μl預冷的（4℃）75mmol/L CaCl₂ 溶液，輕輕吹打菌懸液，放冰浴30min。
   5) 4℃3000rpm/min,離心5min，棄上清。
   6) 菌體沉淀加入200微升預冷的75mmol/LCaCl₂溶液，冰浴4min以上。4℃保存備用。
2. 質粒轉化
   1) 取2個潔凈，滅菌的EP管，加入各成分。　　　　　　　
   2) 上述2個試管充分混均勻后，置冰浴30min。
   3) 42℃2min或37℃5min，立即置冰浴2min。
   4) 加入1ml LB肉湯培養基，37℃靜止培養1h。

3. 轉化子篩選
   1) 取實驗組培養菌液涂布在氨芐青霉素瓊脂平板（50ug/ml）上，對照組菌液分別涂布在無藥LB瓊脂平板和氨芐青霉素瓊脂平板上，每塊板涂0.1ml，用滅菌L形玻璃棒涂勻。將涂好的平板置37℃培養過夜，觀察轉化結果。
   2) E.coli 受體菌不含有質粒DNA，也不含Apr和Tcr 。在含Ap和Tc的培養基中不能生長,若實驗組在含Ap和Tc的平板上出現菌落，可初步確定受體菌獲得了耐藥性質粒，然后再通過提取質粒DNA進一步鑒定轉化子。