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  • 發布時間:2019-04-13 13:21 原文鏈接: 聚丙烯酰胺凝膠不連續圓盤電泳實驗

    實驗方法原理利用各種載脂蛋白在一定pH下所帶電荷數量及顆粒大小不同的差異,從而在電場中獲得不同的遷移庇,達到分離測定的目的,
    試劑、試劑盒

    考馬斯藍溴酚藍水溶液冰醋酸

    實驗步驟

    一、實驗試劑:

    1. 凝膠儲備液制備及工作混合液比例表

    2. 脫色劑:乙醇1000ml,冰醋酸320ml加水至4000ml.

    3. 染色劑:考馬斯藍0.46g,溶于400ml脫色劑中。

    4. 溴酚藍水溶液:溴酚藍0.05g,水溶至100ml。

    二、實驗操作

    1. 按上表所給的比例配制分離膠,3號試劑要最后加,之后快速混勻.立刻往已封底中的玻璃管中加入上述分離膠約至管長的2/3處,然后沿管壁輕輕加入一薄層水封閉空氣.一般在20℃室溫中約40分鐘左右便形成凝膠.傾去水層,倒立在濾紙上將管內水分瀝干,接著按上表已制濃縮膠,6號試劑最后加入,快速混勻,立刻加在分離膠之上距管口上緣8mm處,其上再輕輕加一薄層水,令其在日光燈照射下聚合,約20分鐘左右即可聚合完畢,傾去水層.

    2. 將管底口封閉打開,將裝柱完畢的玻璃管插入電泳槽孔中(分離膠在下面),周圍不得漏水.

    3. 加樣:先將4號液稀釋(取2ml4號液,加水至6m1).取血清0.5m1,加4號液釋液1.5ml,加7號3滴及溴酚藍試劑3滴,混勻.檢查凝膠管上下口是否已浸在緩沖液中,否則要進行調整.用微量加液器吸取上面已經準備好的樣品30-35ul(約含血清7.5ul),沿管壁慢慢將加樣器針頭伸到上端膠面處.將樣品緩緩加到膠面上(要成層不要分散開來)。

    4. 電泳:上槽接負極,下槽接正極,蓋上電泳槽蓋,開啟電泳儀開關調節輸出電壓。使每管電流量為1-2mA,待溴酚藍批示劑進入分離膠后,加大輸出電壓,使每管電流增至4-5mA,當溴酚藍指示劑泳動到距管下次端0.5cm時停止電泳.

    5. 剝膠:比電泳槽上取下膠管,用長針頭注射器吸滿水后,將針頭緊貼管壁慢慢插入,且邊插邊旋轉玻璃管,邊將水注入,使凝膠與內管壁分離開,令其脫出,放入染色液中。

    6. 固定與染色:讓剝出的膠柱在染色液中染色30分鐘,凝膠被國定,蛋白質染上藍色,成若干個圓盤樣區帶。脫去浮色:將染色后的膠柱輕輕轉入小試管中,加入脫色劑浸泡,并多換洗幾次,直至背景清晰及區帶清晰為止.

    展開


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