實驗原理
所有的氨基酸均為兩性物質，即它們至少含有一個羧基（carboxyl）及一個氨基（α-amino）。這些可游離的基團隨著pH變化可以三種形式存在，即正電荷（cation）、兩性離子（zwitterion）及負電荷（anion）等三種，在酸性溶液中帶正電荷，在堿性溶液中帶負電荷。若氨基酸在某一pH值下其凈電荷為0，且在電場中不移動時，稱此pH值為它的pI值（等電點）。因為凈電荷為零，凈電斥力不存在的緣故，大部份蛋白質在等電點的pH值下，其溶解度最小。相反的，當溶液的pH值低于或高于pI，所有蛋白質分子所帶凈電荷為同號，彼此之間有相斥力，不會聚集。所以，將pH調到等電點的大小，則大部份的蛋白質將會沉淀，這種現象可以應用于估算某蛋白質的等電點；另一方面，也可以應用在電泳，達到分離蛋白質混合物的目的，這種方法稱為等電聚焦電泳（isoelectric
focusing），簡稱為IEF(見圖4.8)。
圖4.8 等電聚焦電泳示意圖
上圖左以A，B兩種蛋白質為例，作出它們的凈電荷曲線圖，橫軸代表環境中的pH值，縱軸代表蛋白質的凈電荷，在 pH 6.5時，A帶有兩個正電荷，B帶有一個負電荷。使A與B的凈電荷為0的pH值分別為pH9和pH5，這就是它們的「等電點」。
IEF是在具有pH梯度環境中進行的電泳。將蛋白質置于不同pH梯度的膠體進行電泳，它會朝著與自身所帶電荷相反的電極方向移動，直到抵達等電點（pI）相同的pH值處才停止，如果它移到別的pH處，會因為帶電而再度移動到和它pI相符的pH處。
IEF-PAGE操作簡單，只要一般電泳設備就可進行，電泳時間短、分別率高、應用范圍廣，可用于分離蛋白質及測定pI，也可用于臨床鑒別診斷、農業、食品研究等各種領域。
試劑和器材
一、試劑
Acr－Bis貯存液：29.1g Acr,0.9g Bis, 用無離子水溶解后定容至100ml,不溶物過濾去除后置棕色瓶貯于冰箱。
等電點標準蛋白（pH3－pH10）試劑盒，臨用前稀釋至0.1－0.3mg/mL。
適合于pH3－pH10范圍的電極溶液：
A: 陰極電極溶液（1mol/L NaOH）:稱NaOH(AR)4g，加去離子水使其溶解，冷卻至室溫再定容至100ml；
B: 陽極電極溶液（1mol/L H3PO4）:取H3PO4（85％）6.7ml，加去離子水定容至100ml。
固定液：稱取磺基水楊酸3.5g，三氯乙酸10ml，甲醇35ml，加去離子水至100ml。
染色液：稱取考馬斯亮藍R250 0.1g，冰乙酸10ml，甲醇35ml，加去離子水使其完全溶解，在定容至100ml，過濾后置棕色瓶保存。
脫色液：取無水乙醇50ml，冰乙酸20ml，加蒸餾水至200ml。
保存液：取無水乙醇25ml，冰乙酸10ml, 甘油5ml，加蒸餾水至100ml。
10％過硫酸銨，TEMED, 40%兩性電解質載體（pH3－pH10）。
二、材料
待測已純化的蛋白質樣品（脫鹽），濃度0.5mg/mL。
三、器材
等電聚焦電泳槽, 移液管（1，5，10ml），燒杯（25，50，100ml），細長頭的吸管，微量注射器（10μL或者50μL），漏斗，濾紙，鑷子。
操作方法
一、準備工作
配制凝膠前，應把玻璃板準備好。即將兩塊干凈的玻璃板疊放在一起，之間夾上所需凝膠厚度的膠條進行密封。然后用文具夾將玻璃板四周固定好。注意夾子作用力點在膠條正中，以防漏膠。
二、配制凝膠
取Acr-Bis儲備液2.0ml；兩性電解質0.5ml；去離子水5.5ml；TEMED 8μl置于小燒杯中混勻，再加入10% 過硫酸胺50μl，用磁力攪拌器充分混勻2min。然后用注射器吸凈混合液，排除氣泡，緩緩注入玻璃板的夾隙內。注意勿出現氣泡。
三、電泳
1. 剝膠板 將膠板取出，揭去上層的玻璃板和膠條，然后用蒸餾水輕輕沖洗一下膠面。
2. 點樣 用小紙條（0.5 cm′0.5cm）蘸樣，均勻地點在膠板上，點樣要求整齊、迅速。注意膠板兩邊要留出一定空間。通常把PI在酸性范圍的樣品放在偏堿性的位置（負極），PI偏酸性的樣品放在偏酸性的位置（正極），標準蛋白質混合樣品放在中間。
3. 進樣
將浸入電極液的濾紙條取出，使其分別平直緊貼在膠面兩端，然后放入電泳槽內，注意正負極相吻合。將電極板正極（電極條浸有H3PO4的一側）與負極（電極條浸有NaOH的一側）分別與電泳儀的正、負極連接。接通冷卻水，在室溫下電泳，把電泳儀調至電壓50V，電流以每板膠不超過17mA為準，然后開始電泳。進樣時間一般在1.5－2小時。
4. 揭樣紙 待電流降至每板膠3mA以下時，切斷電源，取出膠板，揭去加樣紙后，將電壓調至220~320V繼續電泳。5. 加壓 當電流降至每板膠3mA以下時，升高電壓至580V，繼續電泳1.5小時左右。
6. 電流降至每板3mA以下時，切斷電源，停止電泳。