一、實驗目的
1．學習PCR基因擴增的基本原理和操作方法。
2．理解PCR基因擴增在分子生物實驗技術中的重要性。
3．了解引物設計的一般要求。
二、實驗原理
多聚酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR )：原理類似于DNA的變性和復制過程，即在高溫（93-95℃）下，待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板；而后在低溫（37～65℃）情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72℃）下，以引物3’端為合成的起點，以單核苷酸為原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新鏈。這樣，每一雙鏈的DNA模板，經過一次解鏈、退火、延伸三個步驟的熱循環后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復進行，每一次循環所產生的DNA均能成為下一次循環的模板，每一次循環都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區拷貝數擴增一倍，PCR產物得以2n的批數形式迅速擴增，經過25～30個循環后，理論上可使基因擴增109倍以上，實際上一般可達106～107倍。
PCR 反應系統的組成:引物、寡核苷酸、Taq DNA聚合酶、模板DNA、緩沖液。
三、試劑與器材
1、試劑10×EX Taq Buffer (Mg2+ plus)
dNTP Mixture (各2.5 mM)
TaKaRa EX Taq聚合酶5U/μl
模板DNA (已預先稀釋)
上、下游引物混合物（已預先稀釋）
2、器材 微量移液器及吸頭，硅烷化的PCR小管，PCR擴增儀(PTC－100)，臺式高速冷凍離心機。
四、操作方法
1．編輯設定PCR擴增程序。
2．PCR管中加入滅菌水、緩沖液、四種dNTP、引物、模板、聚合酶。
3．運行程序進行擴增。
4．電泳檢測擴增結果。
五、關鍵步驟與注意事項
1．試劑濕熱滅菌，小管分裝，防止污染。
2．所用的PCR擴增管、微量移液器的吸頭都要滅菌。
3．試劑混合時要在超凈工作臺中，戴上一次性手套，防止污染；要離心混勻。
4．每次反應都要設置陰性和陽性對照。
5．根據引物的融解溫度設定退火溫度，防止出現非特異性擴增產物。