肌肉的主要組成蛋白質，占肌原纖維總蛋白質的60%，分子量約51萬，是150毫微米長的棒狀分子，一端有兩個頭部。由兩條分子量約20萬的H鏈和四條分子量約1萬7千到2萬5千的L鏈組成。用蛋白分解酶處理可分割為頭部（H-酶解肌球蛋白）和尾部（L-酶解肌球蛋白）。在0.6M KCl溶液中分散成單體，但在0.2M以下的KCl溶液中可形成締合體，自動聚集成1―2微米長的和A絲相似的結構。在肌原纖維內形成長1.5微米寬10―15毫微米的A絲。頭部向外側突出架成橋。頭部的方向表現為鉗在絲的中央部而向相反的方向伸展，結果可以在絲的中央部300毫微米處看到沒有頭部的裸露部分。頭部在A絲上每彎14.3毫微米就移出120°和I絲對應，周期為42.9毫微米。肌球蛋白具有ATP酶活性，在低離子強度下，和肌動蛋白反應，而引起超沉淀，且肌動蛋白能促進ATP酶活性。ATP酶活性和肌動蛋白的反應，表現于頭部的活性基團，可以認為這一部分一面分解ATP，一面進行振頭活動，把I絲拉向A絲的中央部。肌球蛋白的L鏈對ATP酶活性具有重要的作用（參見肌球蛋白L鏈）。肌球蛋白和肌動蛋白一起被認為與全部細胞運動有關，也可從腦、粘菌、海膽卵等分離出來。