分子量與分子量分布照分子排阻色譜法(通則0514)測定供試品溶液取本品適量,加流動相溶解并定量稀釋制成每1ml中約含5mg的溶液。對照品溶液取肝素分子量對照品適量,加流動相溶解并定量稀釋制成每1ml中約含5mg的溶液。
系統適用性溶液取肝素分子量系統適用性對照品適量,加流動相溶解并定量稀釋制成每1m中約含5mg的溶液色譜條件以親水改性鍵合硅膠為填充劑(TSK預柱,6mm×40mm, TSKgel G4000SWXL,7.8mm×300mmTSKgel G300sWXL,7.8mm×300mm,串聯使用);以0.1mol/L醋酸銨溶液為流動相;流速為每分鐘0.6ml;柱溫為30℃;示差折光檢測器;進樣體積25l系統適用性要求系統適用性溶液色譜圖中,主峰與溶劑峰能夠徹底洗脫,重均分子量應在標示值±500范圍內。測定法取對照品溶液,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。
準確計算對照品溶液色譜圖中肝素峰的總面積(不包括鹽峰)及每個點的累積峰面積百分比,確定與肝素分子量對照品附帶的寬分布標樣表中累積峰面積百分比最接近點的保留時間及對應的分子量,以保留時間為橫坐標,分子量的對數值為縱坐標,使用GPC軟件,擬合三次方程,建立校正曲線,相關系數應不小于0.990。另取供試品溶液,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,按下式計算本品的重均分子量Mw=2(RIM;)/∑RI式中RI:為洗脫的i級分的物質量,即示差色譜圖的峰高;M;為由校正曲線計算得出的i級分的分子量。限度重均分子量應為15000~19000,分子量大于24000的級分不得大于20%,分子量8000~16000的級分與分子量16000~24000的級分比應不小于1酸堿度取本品0.10g,加水10ml溶解后,依法測定(通則0631),pH值應為5.5~8.0。蛋白質照蛋白質含量測定法(通則0731第二法)測定供試品溶液取本品適量,精密稱定,加水溶解并定量稀釋制成每1ml中約含30mg的溶液。對照品溶液取牛血清白蛋白對照品適量,精密稱定,分別加水溶解并定量稀釋制成每1ml中各約含0、10g、20pg30g、40g與50μg的溶液。限度按干燥品計算,含蛋白質不得過0.5%。有關物質照高效液相色譜法(通則0512)測定。供試品溶液取本品適量,精密稱定,加水溶解并定量稀釋制成每1ml中約含100mg的溶液,渦旋混合至完全溶解,精密量取0.5ml,加1mol/L鹽酸溶液0.25m1與25%亞硝酸鈉溶液0.05ml,振搖混勻,反應40分鐘,加1mol/L氫氧化鈉溶液0.2ml終止反應。對照品溶液(1)取肝素對照品0.25g,精密稱定,精密加水2ml,渦旋混勻至完全溶解。對照品溶液(2)精密量取對照品溶液(1)1.2ml,加2%硫酸皮膚素對照品0.15ml與2%多硫酸軟骨素對照品 0.15ml 對照品溶液(3)取對照品溶液(2)0.1ml,用水稀釋至1ml對照品溶液(4)取對照品溶液(1)0.4ml,加水0.1ml,混勻,加1mol/L鹽酸溶液0.25ml與25%亞硝酸鈉溶液05ml,振搖混勻,反應40分鐘,加1mol/L氫氧化鈉溶液0.2ml終止反應。對照品溶液(5)精密量取對照品溶液(2)0.5ml,加lmol/L鹽酸溶液0.25ml和25%亞硝酸鈉溶液0.05ml,振搖混勻,反應40分鐘,加1mol/L氫氧化鈉溶液0.2ml終止反應。色譜條件以烷醇季銨為功能基的乙基乙烯基苯乙烯基苯聚合物樹脂為填充劑(AS11-HC陰離子交換柱2mm×250mm,與AG11-HC保護柱,2mm×50mm,或其他適宜的色譜柱);以0.04%磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調節pH值至3.0,0.45m濾膜過濾,臨用前脫氣)為流動相A,以高氯酸鈉-磷酸鹽溶液(取高氯酸鈉140g,用0.04%磷酸二氫鈉溶液溶解并稀釋至1000ml,用磷酸調節pH值至3.0,0.45m濾膜過濾,臨用前脫氣)為流動相B,按下表進行線性梯度洗脫;流速為每分鐘0.22ml;檢測波長為202nm;進樣體積20l時間(分鐘)流動相A(%)流動相B(%)0~1010~3575~025~1035~400100系統適用性要求對照品溶液(4)色譜圖中應不出現肝素峰,對照品溶液(5)色譜圖中硫酸皮膚素與多硫酸軟骨素色譜峰的分離度不得小于3.0。
測定法精密量取供試品溶液,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。限度供試品溶液色譜圖中硫酸皮膚素的峰面積不得大于對照品溶液(5)中硫酸皮膚素的峰面積(2.0%);除硫酸皮膚素峰外,不得岀現其他色譜峰。殘留溶劑照殘留溶劑測定法(通則0861第二法)測定內標溶液稱取正丙醇適量,用水定量稀釋制成每1ml中約含80g的溶液。供試品溶液取本品約2.0g,精密稱定,置10ml量瓶中,加內標溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密量取3ml,置預先加有氯化鈉0.5g的頂空瓶中,密封。對照品溶液取甲醇、乙醇、丙酮適量,精密稱定,用內標溶液定量稀釋制成每1ml中約含甲醇400g、乙醇400g與丙酮80μg的混合溶液,精密量取3ml,置預先加有氯化鈉0.5g的頂空瓶中,密封色譜條件采用6%氰丙基苯基94%二甲基聚硅氧烷或極性相似)為固定液的毛細管柱為色譜柱;起始溫度為40℃,維持4分鐘,以每分鐘3℃的速率升溫至58℃,再以每分鐘20℃的速率升溫至160℃;進樣口溫度為160℃;檢測器溫度為250℃;頂空瓶平衡溫度為90℃,平衡時間為20分鐘系統適用性要求對照品溶液色譜圖中,出峰順序依次為甲醇、乙醇、丙酮、正丙醇,相鄰各色譜峰間分離度均應符合規定測定法取供試品溶液與對照品溶液分別頂空進樣,記錄色譜圖。限度按內標法以峰面積計算,甲醇、乙醇與丙酮的殘留量均應符合規定。鈣取本品0.2g,精密稱定,置500ml錐形瓶內,加水300ml溶解,加10mol/L氫氧化鈉溶液6.3ml與鈣紫紅素指示劑15mg,用乙二胺四醋酸二鈉滴定液(0.05mo/L)滴定至溶液由紫色轉變為純藍色。每1ml乙二胺四醋酸二鈉滴定液(0.05mol/L)相當于2.004mg的鈣。按干燥品計算,本品含鈣(Ca)應為9.5%~11.5%。鈉取本品1.0g,加水100ml溶解后,照原子吸收分光光度法(通則0406第一法),在589.0nm的波長處測定,按燥品計算,不得過0.15%。重金屬取熾灼殘渣項下遺留的殘渣,依法檢査(通則0821第二法),自“滴加氨試液至對酚酞指示液顯微粉紅色”后,加入冰醋酸調至無色,再加人0.5ml冰醋酸。過濾,收集濾液至納氏比色管中,加醋酸鹽緩沖液(pH3.52ml,加水稀釋成25ml,作為乙管,含重金屬不得過百萬分之三十。總氮量、溶液的澄清度與顏色、核酸、干燥失重與熾灼殘渣照肝素鈉項下的方法檢查,均應符合規定細菌內毒素取本品,依法檢查(通則1143),每1單位肝素中含內毒素的量應小于0.010EU