胚胎干細胞來自囊胚的內細胞群（ICM），并進行體外（in vitro）培養取得。胚胎干細胞具有多能性，在一定條件下能夠分化為三個胚層（外胚層、中胚層、內胚層）的細胞，形成生物體的各種結構。胚胎干細胞的形態與基因表達情況與其他細胞有明顯的不同。
形態學
胚胎干細胞為球狀，人胚胎干細胞直徑約為14μm，而鼠胚胎干細胞直徑約為8μm。胚胎干細胞的細胞核一般較大，核仁明顯，而細胞質相對較少。人和小鼠的胚胎干細胞都能在培養皿上形成圓形、邊界清晰、表面光滑的細胞集落。
分子細胞生物學
胚胎干細胞多能性的維持依賴于Sox2、Oct4、Nanog等因子構成的轉錄網絡，確保與細胞自我更新能力有關的基因能夠持續高水平表達，并抑制與分化、自噬相關的基因轉錄。在胚胎干細胞的分化過程中，細胞的基因表達情況會發生很大變化，尤其是與胚胎干細胞自我更新能力維持有關的基因。
胚胎干細胞的自我更新和分化與表觀遺傳學途徑有密不可分的聯系。首先是組蛋白的化學修飾：在胚胎干細胞中，與自我更新相關的基因所在區域組蛋白H3K27高度乙酰化，這些區域中既有組蛋白乙酰基轉移酶，也有去乙酰化酶。這兩種作用效果完全相反的酶使H3K27的乙酰化水平維持動態平衡，便于基因能在外界信號發生改變時迅速關閉。另外，PRC1與PRC2兩種重要的蛋白質會使H3K27、H3K4發生甲基化而沉默與分化相關的基因，使其不表達。胚胎干細胞多能性的維持與RNA干擾也有緊密聯系。比如，PRC1與PRC2還會沉默編碼與分化相關的miRNA，使胚胎干細胞維持多能性；而let-7（一種miRNA）的表達則會使胚胎干細胞開始分化。受精卵發育早期，基因組所有的DNA甲基化都會由甲基轉移酶Dmnt1消除；而與胚胎干細胞自我更新有關的基因區域會在分化過程中再次甲基化，這些基因的表達也隨之停止。
胚胎干細胞多能性的維持還需要依靠胞外微環境提供適宜的信號，否則，胚胎干細胞很容易分化為其他類型的細胞。過去，胚胎干細胞的培養需要在有一層喂養層細胞的培養基上進行。喂養層細胞一般是經絲裂霉素等有絲分裂阻斷劑處理過的胚胎成纖維細胞，這些細胞能分泌特定的信號分子模擬早期胚胎發育的微環境，使胚胎干細胞維持不分化的狀態。目前，在培養基內加入白血病抑制因子（LIF）等細胞信號分子就能夠在無喂養層的培養基上培養胚胎干細胞。