胚胎干細胞可以通過細胞集落或細胞本身的形態初步鑒定；除此之外，還可以從分子標記和分化潛能等兩方面對胚胎干細胞進行鑒定。
各基因的表達情況隨細胞不同而異。因此，可以用一些在細胞中特異性表達的蛋白質對胚胎干細胞進行鑒定。上述特異性表達的蛋白質又分為兩種類型：細胞內的蛋白質以及細胞表面特異性的蛋白質（細胞表面標記）。目前較常用的細胞表面標記有SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81（前兩者為階段特異性胚胎表面抗原，后兩者為腫瘤識別抗原）；而常選為分子標記的細胞內蛋白質則有Oct4和Nanog等。免疫組織化學技術利用能與這些分子標記特異性結合的抗體來鑒定胚胎干細胞，此外，這種技術也能與流式細胞分選術、免疫磁珠等方法結合，用于胚胎干細胞的分離。
特異性分子標記的篩選可以采用轉錄組學與蛋白質組學的技術，將胚胎干細胞與其他細胞比對，以篩選出在胚胎干細胞中特異性表達的蛋白質。。
檢驗分化潛能也可以達到鑒定胚胎干細胞的目的。例如將小鼠的胚胎干細胞注射入其他的小鼠胚胎中，再使這個胚胎發育為完整個體，如果注射的胚胎干細胞具有多能性，最后就能形成嵌合體（即該小鼠的一部分細胞基因型與其他部分不同，該部分細胞來自注射的胚胎干細胞）。但是，考量倫理等方面的議題，上述方法并不適用于人類等動物。鑒定人胚胎干細胞的分化潛能主要有兩種方法：體外培養形成擬胚體（embryoid body，EB）或注射入小鼠體內形成畸胎瘤。在體外低黏附性培養皿上培養人胚胎干細胞（或者懸浮培養人胚胎干細胞）能使胚胎干細胞形成一種特殊的結構，稱為擬胚體，形成擬胚體的胚胎干細胞會分化為三大類分別具有外胚層、中胚層、內胚層細胞特征的細胞，利用不同的分子標記即可鑒定這三個胚層的細胞。如果將人胚胎干細胞注射入小鼠體內，則可以觀察到畸胎瘤的形成，畸胎瘤的一些特征與早期胚胎相似，含有三大類分別具外胚層、中胚層、內胚層細胞特征的細胞。