| 實驗步驟 | 材料與設備
純化的鼠肝質膜（得自實驗 1)
Ti 70 轉頭和帶蓋的聚丙烯離心管
牛血清白蛋白（BSA,1%)
[125I] 胰島素（受體級，DuPont NEN NEX 196)
豬胰島素〔17.5umol/L(0.1 mg/ml), 于 0.001mol/LHCl 中〕（Sigma Chemical Co.I3505)
牛γ-球蛋白（0.4%，于溶液 B)(Miles Laboratories Co.82-041-2)
聚乙二醇 6000(20% 水溶液）
試劑
溶液 B
溶液 C
結合緩沖液（溶解受體用）
(配方，見"試劑的配制" PP.234~240)
操作程序
用 TritonX-100 溶解胰島素受體
比較 TritonX-100 與其他去垢劑從鼠肝質膜上溶解胰島素受體的效率，其結果見表 4-3。
1）取 100~150 mg 純的鼠肝質膜，與 10 ml 溶液 B 混合，再加 4 ml 溶液 4℃孵育 30 min。
2) 懸液 200000 g（Ti 70 轉頭，45000r/min) 離心 30 min, 用巴氏吸管收集上清，注意不要攪動沉淀。
注: 常存在 TritonX-100 不溶的沉淀物，緊粘于管底。
胰島素對溶解受體結合活性的測定
1) 于微量離心管中建立如下反應體系：
從 A 管得出總的結合量，從 B 管得出非特異結合量。
特異結合量=總結合量-非特異結合量。
注：受體純的 [125I] 胰島索（NEX 196) 購自 DuPont NEN 公司，比放射性強度為 2200uCi/nmol。胰島素濃度為 35.5nmol/L。在本試驗中，必須用結合緩沖液將 [125I] 胰島素儲液稀釋至 5nmol/L。在溶解受體的受體結合試驗中需 [125I] 胰島素的終濃度為 500pmol/L，相當于 300-ul 反應體系中加入 30ul 5nmol/L 的溶液。
2) 反應體系在 44℃ 孵育16 h, 或室溫孵育 2 h。
3) 沉淀，將受體結合的胰島素與游離胰島素分開。加入 75ul 含 0.4% 牛γ-球蛋白的溶液 B,44℃ 孵育 5 min。再加 375ul 20% 聚乙二醇 6000, 44℃ 孵育 10 min。混合物于微型離心機中離心 10 min, 收集沉淀。盡量除盡各管上清，計數沉淀的放射性強度。
注：在純化過程中，雖常用聚乙二醇沉淀法測定胰島索受體數，但此法多半會低估結合位點的絕對數，因為沉淀的只是胰島素-受體復合物的一部分（Finn 等，1984)。為測定胰島素對其受體的親和性，要加入幾種不同濃度的未標記胰島素. 使胰島索終濃度為 500pmol/L 至 200nmol/L，如本單元實驗 1 所述。 展開 |
|---|
