胰蛋白酶切蛋白質樣品的制備
雙向薄層電泳與層析分離多肽片段
反向高效液相層析繪制多肽圖譜
| 實驗材料 | 蛋白質 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | 甲醇 電泳緩沖液 |
| 儀器、耗材 | 凝膠電泳 |
| 實驗步驟 | 1. 用單向或者雙向凝膠電泳將 32P 標記的目的蛋白質與其他不需要的成分分開。 2. 電泳結束后，用 50% 甲醇清洗三次，時間控制在 6 小時，去處 SDS 和電泳緩沖液將凝膠放在兩張塞熱玢膜（Bio-Rad) 之間吸干。用放射性墨水在凝膠邊緣點幾個記號。 3. 置于 X 射線片下曝光，在讀片燈下看放射自顯影圖，找到放射標記的目的蛋白帶用干凈刀片小心地切下目的膠帶，放入帶螺帽的離心管用 0.5~1 ml 50 mol/L 碳酸氫銨泡。剝下賽璐玢膜，將膠帶修剪成更小的小條。 4. 加一等份胰蛋白酶（1 μg 溶于 50 mmol/L 碳酸氫銨，TPCK 處理過），于 37℃ 在 360° 旋轉器中消化和洗脫幾小時或者過夜。 5. 10000 g 離心樣品 5 分鐘。小心取出上清，用一小等份做液閃計數估計回收效率。 6. 用真空離心濃縮器（Savant) 抽干上清。在 50 μl 碳酸氫銨中，用 0.5 μg 胰蛋白酶于 37℃ 繼續消化 4 小時。離心抽干樣品，用 20 μl pH 1.9 的電泳緩沖液重懸，以去處殘余的碳酸氫銨。再次離心抽干樣品。此時樣品已可進行電泳。 |
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