酶是細胞產生的以蛋白質為主要成分的生物催化劑，與化學催化劑相比較，具有作用條件溫和、反應專一性強、反應副產物少等優點，因而廣泛應用于醫藥、化工、食品、日化、農業、飼料、環保等領域，應用種類及用量均逐年遞增。例如蛋白酶，應用于醫藥工業中，作為生化藥物促進食物蛋白質消化；應用在食品工業中，水解蛋白質成膚，改善蛋白質溶解性及功能性質；應用在化學工業中，在有機介質中合成膚類物質等。
目前國內許多酶均為粗制品，雜質含量高，對產品影響較大，其銷售和價格受到極大影響。因此，采用新技術、新工藝制備較高純度的酶制品具有巨大的市場前景和經濟效益，是值得開發的新領域。
酶是蛋白質，因此可用提取、分離蛋自質的方法進行純化，獲得相應產品。下面介紹幾種酶的純化新方法。
胰臟是動物的主要消化腺，含有多種酶及生物活性物質，例如核糖核酸酶A 、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和激肽釋放酶等。核糖核酸酶A 分解RNA 的3 ' , 5’-磷酸二酯白酶（包括肪酶）分解蛋白質或肽的肽鍵。胰蛋白酶專一作用于由堿性氨基酸精氨酸及亮氨酸狡基所組成的肽鍵，是由胰蛋白酶原在腸激酶或自身催化下轉化成的有活性的酶，該酶溶于水，不溶于氯仿、乙醇、乙醚和甘油；在pH < 3 時，鈣離子對其有激活作用。糜蛋白酶（EC 3.4.4.5）又稱胰凝乳蛋白酶，有多種類型，均由酶原激活產生。a -糜蛋白酶由3 條鏈組成，其活性中心氨基酸殘基為His37 、Asp102 、Ser195 ，優先水解L-Tyr 和L - Phe 的梭基所形成的肽鍵；該酶PI8 . l- 8 . 6 ，分子量4200 0，最適pH8-9 。彈性蛋白酶( EC 3 . 4 . 4 . 7 ）又稱胰蛋白酶E ，其活性中心為His45 、Asp93 、Ser88 ; pI 為9 . 5 ，最適pH 7 . 4 - 10 . 3 。激肽釋放酶（EC 3 . 4 . 4 . 21 ）是內切水解酶，活性中心為絲氨酸和組氨酸，pI 為3 . 9 - 4 , 37 ，最適作用溫度為37 ℃ ，pH 值為5 -7 . 8 。
蛋白質的分子量不同，其體積有明顯差異，通過一定孔徑的凝膠柱所需的時間不同，因此可用凝膠過濾進行分離；蛋白質表面主要為帶電荷和極性不帶電荷的氨基酸殘基側鏈基團組成的親水區域所占據，這些基團分別與溶液中相反電荷的離子形成雙電層或與水分子形成氫鍵。高濃度中性鹽[例如〔 NH ;]。可破壞雙電層并降低水分子活度，使蛋白質失去保護，相互聚集析出，因此用中性鹽鹽析可初步分離蛋白質。不同蛋白質的等電點有差異，其荷電性質及荷電量不同，可用帶相反電荷的反膠束在常溫下萃取，從而實現部分純化；荷電的側鏈基團可分別與帶相反電荷的離子交換樹脂形成離子鍵，因此用離子交換法也可以分離純化蛋白質；此外，蛋白質表面的疏水區域（或非極性區域）可與疏水性（或非極性）吸附樹脂形成吸附，極性區域則與極性吸附樹脂形成吸附，因此，吸附法也可以部分純化蛋白質。
實例233 反膠束萃取制備胰蛋白酶
胰蛋白酶（EC 3 . 4 . 4 . 4 ）是從豬、牛等哺乳動物胰臟提取的一種以絲氨酸為活性中心的蛋白水解酶，可提高組織、血管的通透性、液化血塊、血膿纖維及壞死組織等，用于治療炎癥、潰瘍、創傷等引起的膿腫及支氣管炎、肺氣腫等。
( 1 ）工藝流程
( 2 ）主要步驟
① 制備粗酶液 稱取定量粗胰酶，其胰蛋白酶活性為25 . 7U /mg，胰淀粉酶活性為18.4U/mg，胰脂肪酶活性為63.7U/mg。將其用pH 值為5 . 25 、濃度為0．2mol / L 的乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解，然后進行真空過濾，收集濾液并用磷酸緩沖液進行稀釋，使胰蛋白酶活性為3-10U / mg ，備用。
② 制備反膠束 將AOT置于100 ℃ 烘箱中干燥至恒重，放入干燥器中冷卻至室溫。然后稱取44.4369 置于配制罐中，加入10L異辛烷，在攪拌下使其形成均勻的分散液，再加入定量蒸餾水，在200r/min的轉速下處理2h ，獲得濃度為0 .lmol / L 的透明AOT-異辛烷反膠束溶液。使用時用異辛烷稀釋10 倍。
③ 萃取 將稀釋10 倍的AOT-異辛烷反膠束置于萃取器中，按照AOT 異辛烷反膠束：粗酶溶液體積比為（2 -3 ) : 1 的比例加入粗酶溶液萃取3 - 4 次，，在300 - 400r / min 的轉速下萃取5 -10min 。如此每次萃取完成后，均進行離心分離，離心機轉速為4000 - 6000r / min ，時間10 -15min 收集、合并離心上層清液，進行反萃取，下層萃余液用于制備胰脂肪酶。
④ 反萃取 將荷載胰蛋白酶的AOT -異辛烷反膠束置于萃取器中，在攪拌下加入等體積的反萃取液進行反萃取15 -20min 萃取液為0．02 -0.05mol / L 的NaCI 溶液。如此反萃取3 次，每次萃取完成后，均進行離心分離，離心機轉速為4000 -6000r / min,時間為15 -20min 。分別收集、合并離心上層清液和下層反萃取液，前者再生后可再次萃取胰蛋白酶，后者進行超濾濃縮。
⑤ 脫鹽、濃縮 將反萃取液置于截留分子量2 萬的超濾膜中，在0 . 1 ～0.2MPa 的壓力下進行脫鹽及濃縮處理，直至處理液體積降低至原液體積的1 / 5 左右時停止，獲得脫鹽濃縮液。
⑥ 干燥 將濃縮液置于凍干瓶中，在-60～-50 ℃ 、真空度為25～5OMPa 的條件下干燥24h ，獲得純化胰蛋白酶凍干粉。
( 3 ）主要指標
淺黃色粉末，胰蛋白酶的總萃取率為74 . 2 % ，胰蛋白酶活性為3145 . 3U/ mg ，純化45 . 16 倍；胰淀粉酶活性為0 . 58U / mg ，降低4 . 66 倍；無脂肪酶活性。
實例234 豬胰中分離核糖核酸酶A、胰蛋白酶、凝乳蛋白酶和激肚釋放酶
采用提取、鹽析、反膠束、離子交換、凝膠分子篩層析等技術，可從豬胰臟中同時獲得核糖核酸酶A 、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和激膚釋放酶，有顯著的經濟效益。
( 1 ）用該方法同時制備上述四種酶的工藝流程
( 2 ）主要步驟
① 提取、鹽析 取0.5kg 豬胰，除脂肪及結締組織后絞碎，加入其3 倍質量的乙酸提取液攪拌提取24h 。提取液溫度為4 ℃ ，pH 值為4 . 0 ，硫酸濃度為0．125mol / L 。提取完成后用4 層紗布過濾，收集濾過液約1250-1300mL ，在攪拌下加入約750g 固體硫酸錢溶解，使溶液達到75 ％飽和度。4000r / min 轉速離心15min , 分別收集上層清液（約1500mL ）和鹽析沉淀物（約40 -45g ）。
② 制備核糖核酸酶A 取收集的上層清液，在攪拌下加入固體硫酸銨溶解，使溶液達到85 ％飽和度。4 000r / min 轉速離心15min ，棄清液。將沉淀溶于等體積蒸餾水，用10 ％乙酸鈉調節pH 值為6 . 0 ，上用濃度為0 .0lmol / L 、pH6 .0磷酸緩沖液（PBS ) 平衡過的CM - SepharoseFF 柱，CM - SepharoseFF 用量與上柱液體積之比為1 : 5 ( g / mL ）。接著用2 倍樹脂床體積的上述平衡緩沖液洗滌荷載核糖核酸酶A 的CM -SepharoseFF 色譜柱后，分別用0．01mol / L 、pH6 ．0和0．lmol / L 、pH7 . 5 磷酸緩沖液進行梯度洗脫，收集活性峰液，調節其pH 值為8 . 0 ，上用0．05mol / L 、pH 8 . 0 磷酸緩沖液平衡的Sephacryls -200 柱，Sephacryls -200 用量與上柱液體積之比為1 : 5 （g/mL ）。然后用同樣的緩沖液梯度洗脫，收集活性峰液，進行透析、脫鹽、凍干，獲得核糖核酸酶A 凍干粉。
③ 制備胰蛋白酶取75 ％飽和度的硫酸錢鹽析沉淀，用10 倍蒸餾水溶解，加入鹽析沉淀質量30 ％的CaCI ：粉末，調節pH 值為8 . 0 ，再加入5 ～ 10mg 粗胰蛋白酶，于4 ℃ 下激活24h 。過濾除去硫酸鈣沉淀，調節濾液pH 值為7 . 8 ，加入定量對氨基苯甲脒－sepharose6B ，攪拌下吸附lh ，紗布過濾，收集濾液用于分離其他酶。將吸附胰蛋白酶的對氨基苯甲瞇一S 叩harose6B 樹脂用pH 值為7 . 8 、濃度為0 . lmol / L Tris 一0 .05mol / L HCI 的緩沖液（含0 . lmol / L CaC12 ）抽濾洗滌，緩沖液用量為樹脂體積的2 倍。洗滌完成后將樹脂裝柱，用其1 倍體積的相同緩沖液平衡。再用20 倍樹脂體積的0 . lmol / L 甲酸-0 . 05mol / L KCI 緩沖液洗脫，洗脫液pH 值為2 . 2 ，洗脫流速為2 ～3 倍樹脂體積／h 。收集洗脫活性峰進行透析，凍干，獲得胰蛋白酶。
④ 彈性蛋白酶制備取未被對氨基苯甲脒-Sepharose6B 吸附的濾液，對水透析至透析管內產生沉淀時止。用400Or / min 的轉速離心15min ，收集上層清液用于制備彈性蛋白酶。沉淀用5 ～ 6 倍體積的Tris-HCI 緩沖液溶解，該緩沖液濃度為0．02mol / L 、pH 值為8 . 8 。將溶解液用稀NaOH 調節pH 值為10 . 4 ，上用上述緩沖液平衡好的DEAE －纖維素柱，溶解液與DEAE -纖維素的比為（5 ～6 ) ： 1 ( mL / g ）。上柱完成后再用同樣的緩沖液以2 ～3 倍樹脂體積／h 的流速洗滌，緩沖液用量為1 倍樹脂體積。彈性蛋白酶在此條件下不被交換，收集洗滌活性峰，對水透析，凍干，即得彈性蛋白酶。比活力2010U / mg ，活力回收10 ％。
⑤ α-糜蛋白酶制備 將制備彈性蛋白酶時的離心清液用乙酸鈉調節pH 值為5 ．0，上用0 . lmol / L 、pH 5 . 0 檸檬酸緩沖液平衡的S- SepharoseFF 柱。用2 倍柱體積的、同樣緩沖液以3mL / min 洗滌樹脂，收集洗滌液待制備激膚釋放酶。用300mL 0 . 01～0.05mol / L 、pH5.0檸檬酸緩沖液梯度洗脫，收集活性峰組分( 160 ～200mL ) ，透析，凍干，即得α-糜蛋白酶。
⑥ 胰糜蛋白酶制備 取制備彈性蛋白酶時的離心上層清液，用乙酸鈉調節pH 值為3 . 5～ 4 . 0 ，加入等體積0.lmol / L AOT 反膠束，在200r /min 攪拌下萃取5min , 4000r / min 離心5min 。收集上層有機相，萃余液再用等體積0.lmol / L AOT 反膠束重復萃取2 次。合并有機相，加入等體積、含lmol / L KCI 、pH8.0的0.02mol / L 碳酸鹽緩沖液，在200r /min 攪拌下反萃取5min , 60 00r/min 離心5min ，收集下層水相，萃余液同法反萃取2 次。合并反萃取液，對水透析脫鹽，凍干，得胰糜蛋白酶。
⑦ 激肽釋放酶制備 取用0.01mol/ L 、pH 5.0檸檬酸緩沖液洗滌S-SepharoseFF 柱的洗滌液，用檸檬酸調節pH 值為4 . 5 ，按洗滌液：丙酮=1：0.35 的比例加入丙酮，于-4 ℃ 冰箱中放置2h , 過濾。濾液中加入乙酸鈉和NaCI ，使其濃度分別達到0.O65mol / L 和0.035mol / L 。繼續加入丙酮，使體積比達到65 ％。抽濾，濾餅用少量蒸餾水溶解，用稀乙酸調節pH 值為4 . 2 ，再次產生沉淀。抽濾，濾餅用少量蒸餾水溶解后用稀乙酸鈉調節pH 值為6 . 8 ，對水透析脫鹽后上用濃度為0.1mol / L 、pH6 . 8 磷酸緩沖液平衡的輕基磷灰石柱，上柱液與經基磷灰石的比為（5 ～ 6 )：l ( mL / g ）。用0 . 01 ～0.2mol/L 、pH6 . 8 磷酸緩沖液以1～ 1 . 5 倍樹脂柱體積／h 進行梯度洗脫，洗脫液用量約為上柱液體積的1～1 . 5 倍。收集活性峰組分，對水透析脫鹽后加到經過重新平衡的另一羥基磷灰石柱上，改用0.05 ～0.2mol / L 、pH6 . 8 磷酸緩沖液進行梯度洗脫。收集活性峰組分，再次對水透析脫鹽后，凍干，獲得激肽釋放酶。
( 3 ）主要指標
核糖核酸酶A 的活力回收≥75 。％，比活力為71000U/mg；胰蛋白酶的活力回收≥60 % ，比活力為23750U / mg ；彈性蛋白酶的活力回收≥10 % ，比活力為2010 U / mg ；胰糜蛋白酶活力回收≥70 % ，比活力為150U / mg ；胰激膚釋放酶活力回收≥6 % ，比活力為130U / mg 。