脂肪酶在催化合成及食品領域的應用

酶有著普通催化劑無可比擬的優越性,已廣泛應用于食品、醫藥、輕紡、洗滌劑及化妝品等工業領域。這些應用大多數是在水溶液中進行的。但許多有價值的產品是水不溶的，同時許多有用的化合物是普通化學方法無法合成的。因此，人們希望找到一種合適的方法來生產這些高價值的重要產品。酶工程的發展有兩個途徑: 一是改造酶本身，如蛋白質工程等；二是改造反應介質，如采用非水介質、超臨界流體等，即溶劑工程等。1984 年,ZaksA 和Klibanov A. M首次發表了關于有機相介質中脂肪酶的催化行為及熱穩定性的研究報道，引起了廣泛的關注。傳統的酶學領域迅速產生了一個全新的分支—非水酶學。現在非水酶學方法在多肽合成、聚合物合成、藥物合成以及立體異構體拆分等方面已經顯示出廣闊的應用前景。酶在有機介質中的催化作用大大拓寬了酶的應用范圍，是酶工程中一個有意義的研究領域。
1 　有機相脂肪酶催化合成技術的研究
目前在非水介質中獲得應用的酶包括氧化還原酶類、轉移酶類、水解酶類及異構酶類, 其中脂肪酶是在有機相中催化反應種類最多、應用最廣泛的酶類之一。脂肪酶是工業上常用的酶之一，研究表明，在水溶液中它能催化油脂和其它酯類的水解反應，在有機介質中也能催化水解反應的逆反應—酯合成反應和酯交換反應。脂肪酶的這種性質顯示它在有機合成中具有極大的應用潛力。脂肪酶作為生物催化劑可運用發酵技術獲得，目前已實現商品化。如丹麥Novo公司生產的Lipozyme脂肪酶，無錫酶制劑廠生產的假絲酵母脂肪酶，南通酶制劑廠生產的青霉脂肪酶等。
1. 1 　非水相酶催化反應體系
非水相酶學的研究在最近20多年里取得了長足的發展,脂肪酶所應用的反應體系也有了較大的改善，主要集中在有機溶劑體系,還有微水條件下的無溶劑體系、微乳液體系、超臨界流體介質體系等。
1. 1. 1 　有機溶劑體系　
有機相酶催化反應體系,最先采用的是有機溶劑或有機溶劑與水的混合物。有機溶劑主要是通過酶分子周圍的水來影響酶的催化活性，溶解于酶周圍水分子層的有機溶劑與酶直接結合會導致酶受抑制或失活；有機溶劑奪去酶分子表面的必需水分，導致酶活下降；因此，溶劑的疏水性越強，對酶活的影響越小。
研究表明,酶的結構在水相和有機相中并沒有顯著的變化，然而適當的水對酶的催化作用是必需的，且不同酶的必需含水量不同，在有機相酶催化反應體系中存在相應的最適水分含量。A1ekery研究了3種不同的酶在不同的有機溶劑中的酶反應，發現在溶解度限制范圍內，酶活都隨著有機溶劑中水分含量的增加而提高，且達到最大酶活所需的水分含量，疏水溶劑比親水溶劑少。
1. 1. 2 　反膠束體系　
在水/有機溶劑兩相體系和微水有機溶劑單相體系中，僅有少數的酶能保持催化活性。由于反膠束體系能較好地模擬酶的天然環境，因而在反膠束體系中，大多數酶能夠保持活性和穩定性，甚至表現出“超活性”。
表面活性劑溶解于有機溶劑,能夠增溶一定量的水,根據水、表面活性劑、有機溶劑三相濃度不同,形成圓球狀或圓柱狀反膠束微粒,形成所謂“油包水”的結構。酶在反膠束體系中的活力主要由三方面的因素決定:核心水團的大小、表面活性劑的種類及反膠束微粒的濃度。由于反膠束模型和組成對酶活性有影響,調節反膠束的特性可使酶更適合于特定的反應,提高反應速度。如將Tween系列的非離子表面活性劑按m(二(2-乙基己基)磺化琥珀酸鈉AOT)：m(吐溫Tween) = 16 ：1 加入AOT 反膠束中，可使C. viscosum 脂肪酶活性提高3倍;將乙醇作助表面活性劑加入AOT 反膠束中,可使角質酶穩定性提高45倍。
由于反膠束酶組成靈活，熱力學穩定，傳質阻力小，產物易于回收,目前反膠束體系酶反應廣泛應用于有機相中脂肪酶催化的酯交換反應、肽和氨基酸的合成以及酶法合成酚及芳香胺聚合物的反應。另外，反膠束中的脂肪酶催化立體選擇性酯化反應對映體的拆分也有重大意義。
1. 1. 3 　超臨界流體　
有機溶劑酶反應產物中,不可避免地殘留了部分有機溶劑,對食品和醫藥造成污染,限制了有機相酶反應的應用。超臨界流體是一種超過臨界溫度和臨界壓力的特殊物質,物理性質介于液體和氣體之間。超臨界流體作為酶反應中間介質,具有明顯的優點:1) 有似液體的密度、似氣體的擴散性和粘度,因此顯示出較大的溶解能力和較高傳遞特性,從而大大降低酶反應的傳質阻力,提高酶反應速率;2) 反應底物的溶解性對超臨界的操作條件(如溫度、壓力) 特別敏感,通過簡單改變操作條件或附加其它設備,可達到反應物和底物分離的目的;3) 無毒、不可燃、化學惰性、易與反應物及底物分離、價格便宜等,這些優點和特點使其在工業上,尤其是在食品與發酵行業上的應用,具有廣闊的發展前景。
水、超臨界流體、酶是構成反應體系的3個要素。目前研究的超臨界流體中的酶反應主要是酯化、酯交換、醇解、水解、氧化等反應。研究最多的是脂肪酶,超臨界CO2 中脂肪酶催化乙酸乙酯和異戊醇的醇解反應,用超臨界CO2 代替庚烷作反應介質,反應速度提高3倍。另外,通過消旋混合物的拆分或手性合成來生產純的旋光異構體,也是超臨界流體酶反應的一個誘人的應用前景。
1. 1. 4 　無溶劑系統　
一般來說,酶反應都是在溶有底物的溶劑中進行的均相反應,選擇對底物溶解性好又不使酶失活的合適溶劑比較困難。無溶劑系統是指反應體系中沒有附加的溶劑,只含有反應物和酶。無溶劑系統具有突出的優點:可避免有機溶劑引起的毒性及易燃問題,這對于食品、化妝品、藥物的生產尤為重要. 無溶劑系統增大了底物濃度,減少了反應的體積,提高了產物的濃度;終產物易于分離純化。
目前,采用無溶劑系統進行酯的合成很普遍,如甘油酯、糖酯、丁酸香葉酯的合成以及橄欖油的內酯化反應等。底物摩爾比、反應溫度、機械攪拌速度以及水活度等都會影響無溶劑系統的酶反應。在利用脂肪酶催化蔗糖單酯的合成中,加入固體水合物Ba(OH)2 , 使反應混合物的水活度保持在0.4 ,明顯提高了產量和酶的區域專一性。
1. 1. 5 　低共熔多相體系　
無溶劑系統只適合于底物為液體的反應。Gill等首先采用低共熔多相體系進行酶促肽合成。低共熔混合物,是指兩種或兩種以上的混合物,在一定組分比率下會表現出比純組分熔點低的低共熔點,并且多相共存。一定組分比率的底物以及適量的水,有時還要加入一定量的輔助劑,就形成酶反應的低共熔多相體系。這一體系的酶反應具有避免使用有機溶劑,適于進行食品、藥物、化妝品等生產,并且環境友好,能獲得高濃度的產物,酶易于回收再利用等優點。
目前低共熔多相體系主要用于生物活性肽、調味肽的合成。酶和底物的選擇、底物比率、輔助劑的選擇、酶用量、水含量等,可影響低共熔多相體系的酶反應。一定量的輔助劑可以改善低共熔體系的形成以及固相在液相中的分散,大大提高反應產率。輔助劑一般是親水的含氧有機溶劑,如醇、酯、醚等,體積分數為8 %～44 %(體積分數) 。
1. 2 　有機相酶催化合成反應體系的水分控制
有機相環境中酶催化合成反應體系中水分的控制是一個難點。酯化反應的副產物是水,水的影響比較復雜。水在有機相酶催化反應中起關鍵作用,脂肪酶催化合成對水的要求很嚴,其主要影響有以下幾個方面:1) 對酶的影響,靠近或結合在酶活性部位的水分對保持酶的微水相環境是必需的。強極性溶劑、親水性過強的低相對分子質量底物或強脫水劑都可能攫取保持酶活所必需的水,從而使酶失活,但過多的水也會降低酶的催化活力; 2) 對產物平衡轉化率的影響,反應體系中水的積累會降低平衡轉化率,抑制熱力學平衡向有利于合成的方向移動,還可能導致產物的水解; 3) 對底物溶解度的影響,Watanabe 等研究表明底物溶解度和溶劑中的水分濃度之間存在如下的關系: Cs =αexp(βCw) ; 4) 對產物組成的影響, 在合成脂肪酸糖酯的反應中,脫水過強會導致不希望的二酯或三酯等副產物形成,既降低了目標產物單酯的得率,又降低其純度,增加分離純化難度。因此,有機相脂肪酶催化反應體系的水分控制是一個非常復雜的課題,還有很多理論有待研究,必須采用一個適宜的動力學脫水過程以達到最適的熱力學脫水效果。
有機相脂肪酶催化反應中常用的控制水分的方法有很多種,如在反應過程中采用減壓法使副產物水等蒸發從而使平衡移動;用吸附的辦法脫水,如加入氧化鋁、硅膠、沸石、分子篩等,這類方法比較常見;其他方法還有添加飽和鹽溶液;加入強酸型陽離子交換樹脂等。所有這些方法目前都還處于試驗階段,存在很多缺陷。如蒸發法,利用水與有機溶劑形成共沸體系后減壓時容易去除的原理,通常認為該方法可應用于較大規模的反應體系。但實際使用中局限性很大,一般只適用于醇類溶劑,對于食品安全許可的兩種溶劑(己烷和丙酮)則不合適,因為其沸點都比水低得多,減壓蒸發時溶劑首先逸出,脫水效果不佳。
吸附法尤其是分子篩脫水是目前應用最廣泛的方法。因為分子篩脫水效果相對比較好,成本低廉,且容易分離和再生。但使用不當也有不利的一面,如由于脫水太強烈而導致酶必需的結合水的去除,使酶失活或脫水太強烈而導致副產物的形成等。
2 　有機相脂肪酶催化合成技術在食品及相關領域的應用
有機相脂肪酶催化在食品、制藥、精細化工、有機合成等領域有廣闊的應用前景,世界各國都對有機相脂肪酶催化合成活性物質的技術非常重視。有機相脂肪酶催化合成技術在食品及其相關領域的應用研究主要有以下幾個方面.
2. 1 　天然抗氧化劑及健康食品
不飽和脂如EPA、DHA 、花生四烯酸等,因為對人們健康有益,在食品、化妝品、醫藥方面應用潛力很大。但實際上目前應用還很有限,因為這些不飽和脂肪酸極易氧化,使油脂產生異味,并有毒副作用。延遲油脂氧化最簡單的辦法是加入抗氧化劑,如BHA 、BHT等,但因懷疑其有致癌作用,現用量已經下降。人們更愿意用天然、安全的抗氧化劑,如抗壞血酸,常以抗壞血酸棕櫚酸酯溶液或反相膠囊方法應用。但這兩種方法的效率不高,主要因為易氧化成分和抗氧化劑的接觸不好。有意義的解決辦法是通過形成酯鍵把多不飽和脂肪酸和抗壞血酸緊密結合在一起。脂肪酶催化反應由于選擇性高,反應條件溫和,比化學反應更適合上述目的, 而且避免了底物的改變。脂肪酸VC酯,本身可作為營養性添加劑、乳化劑,還是一種有效的抗氧化劑,對自身或其他不飽和脂肪酸都有很好的保護作用。
2. 2 　油脂化學工業
單甘酯(有時包括二甘酯) 是一類重要的食品級乳化劑,可以通甘油和游離脂肪酸或其他酰化基團在有機相經脂肪酶催化合成。中等鏈長的三酰化甘油酯,由于中等鏈長(M) 和長鏈(L) 酰化基團的代謝不同,每種類型均有其特殊的營養價值,所以人們希望能制備具有兩種不同鏈長的三酰化甘油,特別是長鏈脂肪酸在sn-2位的MLM型產物。這類化合物的制備可以通過酸解反應和內酯化反應來實現。但MLM三酰化甘油的最好制法是兩步法,首先在有機相脂肪酶催化生成2-單甘酯,然后進一步經脂肪酶催化合成sn-1,3 中等鏈長脂肪酸酯,sn-2 位長鏈脂肪酸酯的最終產物。三酰化甘油中EPA ,DHA 的強化可以通過甘油和多不飽和脂肪酸或其酯在有機相經脂肪酶催化轉化而實現。
2. 3 　生物柴油
生物柴油是一類以天然植物油為原料制成的脂肪酸單酯,具有清潔、可再生、安全性好等優點,是一種真正的綠色能源,可完全替代礦物油作為燃料。生物柴油的特點有: 1) 優良的環保特性。生物柴油含硫量低,可使二氧化硫和硫化物的排放減少約30%。生物柴油不含對環境造成污染的芳香烴。與普通柴油相比,其尾氣中有毒有機物排放量僅為10 % ,顆粒物為20% ,CO2 和CO排放量僅為10%。生物柴油可達到美國“清潔空氣法”所規定的健康影響檢測的要求。檢測表明,使用生物柴油可降低90%的空氣毒性。美國加利福尼亞一大學所作的研究表明,與使用柴油相比,使用生物柴油可降低94%的患癌率;2) 較好的發動機低溫啟動性能,無添加劑冷凝點達220℃;3) 較好的潤滑性能,可降低噴油泵、發動機缸體和連桿的磨損率,延長其使用壽命;4) 較好的安全性能,其閃點高,不屬于危險品;5) 良好的燃料性能,其十六烷值高,燃燒性能優于普通柴油;6) 具有可再生性,生物柴油作為一種可再生能源,其資源不會枯竭。
目前生物柴油主要用化學法生產,即用動物和植物油脂與甲醇或乙醇等低碳醇在酸性或堿性催化劑和高溫(230～250 ℃)下進行轉酯化反應,生成相應的脂肪酸甲酯或乙酯,再經洗滌干燥即得生物柴油。化學法合成生物柴油具有以下缺點:工藝復雜,醇必須過量,后續工藝必須有相應的醇回收裝置;能耗高、色澤深,脂肪中含有不飽和脂肪酸,高溫下容易變質;酯化產物難于回收,成本高;生產過程有廢堿液排放。為解決上述問題,人們開始研究用生物酶法合成生物柴油,制備相應的脂肪酸酯。酶法合成生物柴油具有條件溫和、醇用量小、無污染物排放;副產品甘油較易回收,操作方便;反應物中的游離脂肪酸能完全轉化成酯等優點。
2. 4 　天然風味物質
短鏈脂肪酸的乙基或異戊基酯等具有強烈的水果香味,是食品、飲料、化妝品和制藥中廣泛應用的香味、風味劑。天然提取物或發酵法生產的天然風味酯由于產量低,價格高,商業上難于推廣應用,目前正在研究利用脂肪酶催化合成技術滿足人們對天然風味物質不斷增加的需要,該方法比化學法反應專一,條件溫和,比微生物發酵法產量高。
常見產品見表1 。
表1 　固定化酶催化合成的酯產品
Tab. 1 　Ester productions by immobilized lipase catalyzed synthesis
酯轉化率 / %
丙酸乙酯 76
丁酸乙酯 100
己酸乙酯 44
庚酸乙酯 84
辛酸乙酯 100
月桂酸乙酯 52
異丁酸乙酯 72
異戊酸乙酯 3
乙酸異丁酯 25
乙酸異戊酯 24
丁酸異戊酯 91
2. 5 　天然表面活性劑與乳化劑
天然表面活性劑嚴格而言,應該是由植物或動物來源的產品經過提取、沉淀或蒸餾等簡單加工獲得的,有機合成產物不屬此列。實際使用的表面活性劑中滿足這些要求的產品不多,原因在于其生產成本,天然表面活性劑其分離提取過程非常麻煩,費用遠遠超過相當的合成表面活性劑的生產成本。因此,天然表面活性劑經常是廣義地理解,只要是用天然原材料通過生物轉化技術合成的表面活性劑通常多稱為天然表面活性劑。恰當的例子就是糖或氨基酸的脂肪酸酯。
脂肪酸糖酯化合物是在自然界中廣泛存在的一類在細胞膜上承擔物質傳輸和能量傳遞的具有重要生理活性的物質,同時該類物質還具有兩親結構,能降低水的表面張力形成膠束,是一類重要的非離子生物表面活性劑。糖酯是由碳水化合物分支作為親水基團,一個或多個脂肪酸作為疏水基團組成的非離子表面活性劑,廣泛應用于食品、化妝品、醫藥、洗滌劑、纖維工業中。
目前,糖酯大規模的生產方法一般是利用碳酸鉀作催化劑,在不同的反應條件下酯交換合成,其中最常用的方法有Snell法、無溶劑法和微乳膠法等。由于糖是多羥基化合物,化學合成的選擇性很低,反應又多是在高溫下堿性催化,反應條件比較激烈,實際生成的產物可能是單酯、二酯、多酯和副產物的混合物,而且生產中存在色澤加深問題,所以傳統化學法合成的糖酯在食品中的應用受到了很大限制。
脂肪酶催化合成糖酯是近幾年出現的合成糖酯的新方法,由于脂肪酶具有高立體選擇性、區域專一性和位置選擇性,因而可合成化學法難以合成的、具有光學活性的糖酯,而且反應條件溫和,很少或幾乎沒有副反應,產品易于純化、色澤淺,能耗低,這些為乳化劑的進一步擴大應用提供了可能性。
國內外在脂肪酶催化糖酯合成領域,特別是在合成工藝的優化方面,已做了很多研究,為糖酯的進一步開發、應用提供了可能性。目前酶法合成糖酯的工藝主要有二類。一類是由脂肪酸和糖進行酯化反應,如Ghoul等用C8-C18的脂肪酸合成果糖酯,Yan 等合成葡萄糖脂肪酸單酯;另一類是通過糖和脂肪酸酯的轉酯化反應合成,如Ferrer等以蔗糖和相應的脂肪酸乙烯酯為底物轉酯化合成6-O-月桂酸蔗糖酯和6-O-棕櫚酸蔗糖酯。
2. 6 　護膚產品
維生素A及其衍生物在化妝品如護膚產品等方面極具商業潛力,VA 還是重要的添加劑,廣泛用于食品、飼料的營養強化。但VA 非常不穩定, 很容易被空氣氧化或由于紫外線失活,而且VA 對于皮膚刺激性較強。通過把VA 轉化為VA 酯可以減少光致降解和刺激。多種化學方法可以合成視黃醇酯,但產量較低,且最終產物中有化學殘留。在有機溶劑中用酶催化的生物學方法來生產視黃醇酯,能有效地進行區域選擇性和對映體選擇性的酯化或轉酯化。
皮膚角質層的彈性取決于其組分,水和吸濕性物質,很多水化潤膚劑和潤濕劑用于軟化增厚的表皮,滋潤皮膚。短鏈α-羥基酸如乳酸,羥基乙酸被認為是特別好的脫落劑和潤濕劑。但是α-羥基酸(AHAs) 穿透到深層表皮的速度太快,過高質量分數(高于10%) 使用對皮膚有刺激性。為解決這個問題,可以把AHAs嫁接到親油性適中的基團上。兩性分子如烷基配糖物可以作為較好的AHAs載體,從而能穿透到表皮的內細胞空間。葡萄糖基和α-羥基酸之間形成的酯鍵很容易被表皮酯酶水解,從而實現AHAs有效而緩慢地釋放到皮膚中。
2. 7 　含糖單體和生物可降解的含糖聚合物
高相對分子質量的含糖聚合物是生物可降解的，含有大量的羥基基團,可用作生產高溶脹凝膠、粘度增強劑、藥物傳輸基質的材料。脂肪酶催化各種單糖和乙烯基丙烯酸鹽的酯化反應生成6-丙烯酸酯，通過化學聚合，形成水溶性的聚丙烯酸酯，進一步交聯可得到不溶材料，具有自身質量50倍的吸水能力。Park等用Novozym-435合成了蔗糖6,6’2-O-二乙烯基己二酸酯和海藻糖6,6’-O-二乙烯基己二酸酯，利用這些二酯作為單體進一步酶促合成相對分子質量22000左右的直鏈聚合物。日本學者合成了6-O-乙烯基己二酸葡萄糖酯和6-O-乙烯基癸二酸葡萄糖酯。張曉鳴等利用最簡單便宜的乙烯基乙酸合成了6-O-乙烯基乙酸葡萄糖糖，在此基礎上合成了相對分子質量在5000左右的水溶性聚合物。
脂肪酸纖維素酯被認為是潛在的生物可降解塑料。纖維素和脂肪酸都來源廣泛，價格相對低廉。目前商品纖維素酯是通過酸酐和硫酸催化的異相化學反應產生的，但這種反應局限于四碳或四碳以下的短鏈酯。當酰基分支含6個或更多個碳原子時纖維素酯的熱塑性明顯改善，這種酯可以通過纖維素的葡萄糖基團的羥基和長鏈飽和脂肪酸直接酯化，如用酸性氯化物、吡啶催化異相反應。但酶法生產纖維素酯比化學法有更多優點，有機相中的酶催化反應尤其是脂肪酶已經廣泛地用于脂肪醇、萜烯醇、糖等各種物質的立體、區域選擇性酰化反應。
3 　結　語
與化學合成法相比，酶催化合成有許多優越性：反應選擇性高，條件溫和；產品容易分離純化，反應過程中副產物很少；產品具有很強的綠色環保概念，可謂是“用干凈的技術生產干凈的產品”。非水相脂肪酶合成技術在食品及相關領域的研究目前已有很多報道，但大都還處于應用基礎研究階段，脂肪酶催化合成的工業化嘗試還不多。隨著基因工程和蛋白質工程的發展,脂肪酶成本將不斷降低，而酶活和穩定性不斷增高，酶法清潔生產的優越性必將促進這一領域的突破性發展，有機相脂肪酶催化生物轉化技術代表了未來產業的發展方向。