（1）脂肪酸的活化：脂肪酸的氧化首先須被活化，在ATP、CoA-SH、Mg2+存在下，由位于內質網及線粒體外膜的脂酰CoA合成酶，催化生成脂酰CoA。活化的脂肪酸不僅為一高能化合物，而且水溶性增強，因此提高了代謝活性。
（2）脂酰CoA的轉移：是在胞液中進行的，而催化脂肪酸氧化的酶系又存在于線粒體基質內，故活化的脂酰CoA必須先進入線粒體才能氧化，但已知長鏈脂酰輔酶A是不能直接透過線粒體內膜的，因此活化的脂酰CoA要借助肉堿（camitine），即L-3羥-4-三甲基銨丁酸，而被轉運入線粒體內，在線粒體內膜的外側及內側分別有肉堿脂酰轉移酶I和酶Ⅱ，兩者為同工酶。位于內膜外側的酶Ⅰ，促進脂酰CoA轉化為脂酰肉堿，后者可借助線粒體內膜上的轉位酶（或載體），轉運到內膜內側，然后，在酶Ⅱ催化下脂酰肉堿釋放肉堿，后又轉變為脂酰CoA。這樣原本位于胞液的脂酰CoA穿過線粒體內膜進入基質而被氧化分解。一般10個碳原子以下的活化脂肪酸不需經此途徑轉運，而直接通過線粒體內膜進行氧化。
（3）脂酰CoA的β氧化：脂酰CoA進入線粒體基質后，在脂肪酸β氧化酶系催化下，進行脫氫、加水，再脫氫及硫解4步連續反應，最后使脂酰基斷裂生成一分子乙酰CoA和一分子比原來少了兩個碳原子的脂酰CoA。因反應均在脂酰CoA烴鏈的α，β碳原子間進行，最后β碳被氧化成酰基，故稱為β氧化。
a 脫氫：脂酰CoA在脂酰基CoA脫氫酶的催化下，其烴鏈的α、β位碳上各脫去一個氫原子，生成α、β烯脂酰CoA（trans-y-enoylCoA），脫下的兩個氫原子由該酶的輔酶FAD接受生成FADH2。后者經電子傳遞鏈傳遞給氧而生成水，同時伴有1.5分子ATP的生成。
b 加水：α、β烯脂酰CoA在烯酰CoA水合酶的催化下，加水生成β-羥脂酰CoA（βhydroxyacylCoA）。
c 再脫氫：β-羥脂酰CoA在β-羥脂酰CoA脫氫酶（L-βhydroxyacylCoAdehydrogenase）催化下，脫去β碳上的2個氫原子生成β-酮脂酰CoA，脫下的氫由該酶的輔酶NAD+接受，生成NADH+H+。后者經電子傳遞鏈氧化生成水及2.5分子ATP。
d 硫解：β-酮脂酰CoA在β-酮脂酰CoA硫解酶（β-ketoacylCoAthiolase）催化下，加一分子CoASH使碳鏈斷裂，產生乙酰CoA和一個比原來少兩個碳原子的脂酰CoA。以上4步反應均可逆行，但全過程趨向分解，尚無明確的調控位點。
1分子軟脂酸含16個碳原子，靠7次β氧化生成7分子NADH+H+，7分子FADH2，8分子乙酰CoA，共生成：7×1.5+7×2.5+8×10=108分子ATP，而所有脂肪酸活化均需耗去2分子ATP。故1分子軟脂酸徹底氧化凈生成：7×1.5+7×2.5+8×10-2=106分子ATP。