（1）脂肪酸的活化：脂肪酸的氧化首先須被活化，在ATP、CoA-SH、Mg2+存在下，脂肪酸由位于內質網及線粒體外膜的脂酰CoA合成酶催化生成脂酰CoA。活化的脂肪酸不僅為一高能化合物，而且水溶性增強，因此提高了代謝活性。
（2）脂酰CoA的轉移：脂肪酸活化是在胞液中進行的，而催化脂肪酸氧化的酶系又存在于線粒體基質內，故活化的脂酰CoA必須先進入線粒體才能氧化，但已知長鏈脂酰輔酶A是不能直接透過線粒體內膜的，因此活化的脂酰CoA要借助L-肉堿（L-carnitine），即L-3-羥基-4-三甲基銨丁酸，而被轉運入線粒體內，在線粒體內膜的外側及內側分別有肉堿脂酰轉移酶I和酶Ⅱ，兩者為同工酶。位于內膜外側的酶Ⅰ，促進脂酰CoA轉化為脂酰肉堿，后者可借助線粒體內膜上的轉位酶（或載體），轉運到內膜內側，然后，在酶Ⅱ催化下脂酰肉堿釋放肉堿，后又轉變為脂酰CoA.這樣原本位于胞液的脂酰CoA穿過線粒體內膜進入基質而被氧化分解。一般10個碳原子以下的活化脂肪酸不需經此途徑轉運，而直接通過線粒體內膜進行氧化。
（3）脂酰CoA的β氧化：脂酰CoA進入線粒體基質后，在脂肪酸β氧化酶系催化下，進行脫氫、加水，再脫氫及硫解4步連續反應，最后使脂酰基斷裂生成一分子乙酰CoA和一分子比原來少了兩個碳原子的脂酰CoA.因反應均在脂酰CoA烴鏈的α，β碳原子間進行，最后β碳被氧化成酰基，故稱為β氧化。
（4）硫解：在β-酮脂酰CoA硫解酶（β-ketoacyl-CoA thiolase）作用下，β-酮脂酰CoA被一分子CoA所分解，生成一分子乙酰CoA和一分子比原來少兩個碳原子的脂酰CoA。少了兩個碳原子的脂酰CoA，可再次進行脫氫、水化、再脫氫和硫解反應，每經歷上述幾步后即脫下一個二碳單位（乙酰CoA）。