脈沖場凝膠電泳制備DNA（哺乳動物細胞和組織DNA的分離）

細胞或組織樣品

EDTAL 緩沖液磷酸緩沖鹽液紅細胞裂解緩沖液TE

低熔點瓊脂糖Sorvall SS-34 或相當的轉頭紗布玻璃勻漿器細胞計數板LeucoPrep 細胞分離管研缽和研杵水浴

一、材料

1. 緩沖液和溶液

EDTA ( 0.5 mol/L, pH 8.0)

L 緩沖液（0.1 mol/L EDTA (pH 8.0)，0.01 mol/L Tris-Cl（pH 7.6)，0.02 mol/L NaCl，4℃ 貯存）

含蛋白酶 K 和十二烷基肌氨酸鈉（Sarkosyl) 的 L緩沖液

磷酸緩沖鹽液（PBS)

紅細胞裂解緩沖液（155 mmol/L NH₄CI，0.1 mmol/L EDTA，12 mmol/L NaHCO₃，用此緩沖液分離白細胞）

TE ( pH 7.6)

含 40 μg/ml PMSF 的 TE pH 7.6

2. 凝膠

低熔點瓊脂糖（1%)

3. 離心機和轉頭

Sorvall SS-34 或相當的轉頭

4. 專用設備

紗布

帶有緊配合杵頭的玻璃勻漿器，冰中預冷。

細胞計數板

LeucoPrep 細胞分離管（Becton Dickinson)

研缽和研杵，預冷到 -70℃

42℃ 和 50℃ 水浴

5. 細胞和組織

細胞或組織樣品

二、方法

1. 制備細胞或組織樣品。

(1) 培養細胞

① 用冰冷的 PBS 洗生長中的培養細胞 3 次。

② 用無菌的橡膠制刮細胞器收集至一個小體積冰冷的 PBS 內。

③ 以約 2X10⁷ 個細胞/ml 的濃度在冰冷的 L 緩沖液中混懸細胞。

(2) 新鮮組織樣品

① 在培養皿內，用清潔的手術刀將新鮮組織切割成小塊（1~2 mm³)。用預冷的玻璃勻漿器在冰冷的 PBS 內勻漿。

② 經兩層紗布過濾除去結締組織碎片。

③ 用冰冷的 PBS 洗混懸的細胞 3 次，再以約 2X10⁷ 個細胞/ml 的濃度在冰冷的 L 緩沖液中混懸細胞。

用血球計數器計算細胞數。

(3) 冰凍組織樣品

① 用 -70℃ 預冷的研缽將冰凍組織研成粉末，然后混懸在冰冷的 PBS 中。

② 經兩層紗布過濾除去結締組織碎片。

③ 用冰冷的 PBS 洗混懸的細胞三次，再以約 2X10⁷ 個細胞/ml 的濃度在冰冷的 L 緩沖液中混懸細胞。

(4) 血液白細胞樣品

① 用 LeucoPrep 細胞分離管經離心將 5~10 ml 血液粗分出白細胞和紅細胞。

② 加 4 倍體積的紅細胞裂解液到淡黃色的白細胞層，顛倒 2~3 次輕輕混合。

③ 在緩沖液中室溫下溫育 5 min，然后 3000 g ( 相當 Sorvall SS-34 轉頭 5000 r/min）室溫下離心 5 min。

④ 在室溫將沉淀用 1 ml PBS 混懸。

2. 用 L 緩沖液配制一體積 1% 低熔點瓊脂糖，它相當于步驟 1 中細胞制備的體積。冷卻熔化的瓊脂糖到 42℃。

3. 瓊脂糖降溫至 42℃ 時，溫熱細胞懸液（步驟 1 ) 到相同溫度。混合熔化的瓊脂糖和混懸的細胞。用封口的巴斯德吸管攪動混合物以保證細胞完全均勻分散到瓊脂糖中。

4. 吸出熔化的混合物移入預制的 Plexiglas 模具（50~100 μl，PHarmacia 或 BioRad )，或將混合物吸至適當長度的 Tygon 管（內徑 1/8 英寸或 3.2 mm ) 或 1 ml 塑料注射器內。室溫放置模具 15 min, 然后移至 4℃ 放置 15~30 min。

5. 瓊脂糖凝結后，從 Plexiglas 模具輕輕收集凝膠栓，或者從 Tygon 管或注射器管輕輕吹出凝膠栓，放在培養皿內。將圓柱狀的凝膠栓切成長 1 cm 的段。

6. 將凝膠栓移入 3 倍體積的含 0.1 mg/ml 蛋白酶 K 和 1% (m/V) Sarkosyl 的 L 緩沖液內。50℃ 溫育 3 h。再用兩倍體積新鮮的上述緩沖液替代用過的，繼續 50℃ 溫育 12~16 h。

7. 50 倍體積 TE ( pH 7.6) 3 h 內安排 3~5 次換液，室溫溫育凝膠栓。

8. 除去 TE，用兩倍體積含 40 μg/ml PMSF 的 TE ( pH 7.6）50℃ 溫育 30 min。

9. 用 50 倍體積 TE (pH 7.6) 3 h 內安排 3~5 次換液，室溫溫育凝膠栓。