臍血臍帶中干細胞分離實驗—臍血來源胚胎樣干細胞分離

臍帶血來源的MNCs(CB-MNCs)

滅菌培養基TPOFLK細胞因子混合物（10 ng mL促血小板生成素50 ng mL Flt-3配體和20 ng mL c-kit配體）ACD-A緩沖液小鼠抗人CD45CD33CD47單克隆抗體抗血型糖蛋白A抗體2%人丙種球蛋白（HAG。用PBSA溶解）磁珠標記的人IgG4抗總小鼠IgG單克隆抗體0.05%胰蛋白酶含EDTAPBSA

磁分離器6孔培養板

(a)分離和制備CB-MNCs。

(b)根據以下免疫磁珠分選的方法純化原始系限制性干細胞。

(c)用2%HAG處理MNCs，4℃放置20 min。

(d)用小鼠抗人CD45,CD33，CD37和抗血型糖蛋白A單克隆抗體標記MNCs，4℃標記30 min。

(e)用ACD-A緩沖液洗細胞，400g，4℃離心10 min。

(f)用ACD-A緩沖液再洗一遍。

(g)用磁珠標記的人IgG4抗總小鼠IgG單克隆抗體標記MNCs 30 min。

(h)根據產品說明書用磁分離器分離系特異性分子陰性（Lin-)的細胞群體。

(i)按以下步驟安裝細胞分離裝置和硅酮管：用70%乙醇灌洗10min。用水洗兩遍，每次5 min。用5%BSA/PBSA潤洗。用彈簧夾夾住硅酮管的下段，用帶子將硅酮管安全地固定在磁分離器中。

(j)分離細胞前，用培養基加滿細胞分離裝置中的硅酮管，使通過柱子的流速控制在5mL/min以內。然后，用微量吸管將細胞/磁珠混合懸液加到管中，剛好低于液體的彎月面。

(k)用巴氏吸管，不斷添加培養基，防止管上的細胞脫水。

(l)用15mL離心管收集流出的部分（含沒有結合磁珠的細胞，Lin-細胞）。

(m)用臺盼藍染色進行活細胞計數。

(n)用含TPOFLK細胞因子混合物的培養基將UCB來源的Lin細胞接種到沒有包被過的6孔培養板中，接種濃度為2.7×10⁴個細胞/mL。

(o)將細胞在37℃,5% CO₂的條件下培養，每周一次更換培養基和細胞因子。

(P)必要時，用0.05%胰蛋白酶/EDTA消化貼壁細胞，按1×10⁵個細胞/mL濃度接種到新培養瓶中，按上述條件繼續培養細胞。