膜鉗片
| 實驗材料 | 細胞組織 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | 硅酮樹脂 電極液 |
| 儀器、耗材 | 膜片微電極 濾膜 防震工作臺 屏蔽罩 儀器設備架 單色光系統 膜片鉗放大器 刺激器 數據采集的設備 微操縱器 |
| 實驗步驟 |
第一步是分兩次拉制，第一次拉長7～10mm，直徑小于200μm，在此基礎上進行第二次拉制，最終使尖端的直徑為1～2μm，兩步拉制的目的主要是使電極前端的錐度變大，狹窄部長度縮短，因此可降低電極的串聯電阻，也可減少全細胞記錄時的電極液透析時間。由于膜片微電極最忌沾染灰塵和臟物，更忌觸碰尖端附近部位，所以一般要求在使用前制作。
第二步是在電極前端涂以硅酮樹脂（sylgard），其目的是為了降低電極與灌流液之間的電容，并形成一個親水界面。經此處理后，上述電容可由6～8pF減少到1pF以下。硅酮樹脂對形成Giga?鄄seals無影響，但可減少本底噪音，對單通道記錄很重要。在進行全細胞記錄時，不用硅酮樹脂也可以得到滿意的效果，通常微電極在涂抹硅酮樹脂后再進行拋光，但最好是在涂抹后一小時內拋光，否則很難改變電極尖端的形狀。
第三步是拋光，將電極固定于顯微鏡工作臺上，在鏡下將尖端靠近加熱絲，當通電加熱時，可見電極尖端微微回縮，此時電極變得光滑，且尖端的雜質燒去，得到較干凈的表面。從而有利于和細胞膜緊密封接，并在封接后更易保持穩定。
電極在實驗前要灌注電極液，由于電極尖端較細，因此在充灌前，電極內液要用0.2 μm的濾膜進行過濾。一般電極充灌可分灌尖(tipfilling)和后充(backfilling)兩步。灌尖時將電極尖端浸入內液中5s即可，由于毛細作用溶液會進入電極最尖端處，然后從電極后端用細小的聚丙烯注射管插至尖端附近將溶液充至1/4長度，用手指輕輕彈除尖端殘留的氣泡即可。灌注后的電極電阻一般為2～5MΩ，而全細胞記錄則最好在2～3MΩ。
3. 膜片鉗實驗系統 根據不同的電生理 實驗要求，可以組建不同的實驗系統，但有若干共同的基本部件，包括機械部分（防震工作臺、屏蔽罩、儀器設備架）、光學部分（顯微鏡、視頻監視器、單色光系統）、電子部件（膜片鉗放大器、刺激器、數據采集的設備、計算機系統）和微操縱器。
在大多數膜片鉗實驗，要求所有實驗儀器及設備均具有良好的機械穩定性，以使微電極與細胞膜之間的相對運動盡可能小。防震工作臺放置倒置顯微鏡 和與之固定連接的微操縱器，其他設備置于臺外。屏蔽罩由銅絲網制成，接地以防止周圍環境的雜散電場對膜片鉗放大器的探頭電路的干擾。儀器設備架要靠近工作臺，便于測量儀器與光學儀器配接。
倒置顯微鏡 是膜片鉗實驗系統的主要光學部件，它不僅具有較好的視覺效果，便于將玻璃電極與細胞的頂部接觸，而且是借助移動物鏡來實現聚焦，具有較好的機械穩定性。視頻監視器主要是用來監視實驗過程中的操作，特別是能將封接參數（如封接阻抗）與細胞的形態對應，以實現良好的封接。
膜片鉗放大器是整個實驗系統中的核心，它可用來作單通道或全細胞記錄，其工作模式可以是電壓鉗，也可以是電流鉗。從原理來說，膜片鉗放大器的探頭電路即I-V變換器有兩種基本結構形式，即電阻反饋式和電容反饋式，前者是一種典型的結構，后者因用反饋電容取代了反饋電阻，降低了噪聲，所以特別適合超低噪聲的單通道記錄。由于供膜片鉗實驗的專用計算機硬件及相應的軟件程序的相繼出現，使得膜片鉗實驗操作簡便、效率提高。如與EPC-9型膜片鉗放大器（內含ITC-16數據采集/接口卡）配套使用的軟件PULSE/PULSEFIT，它既可產生刺激波形，控制數據采集，又可分析數據，同時具有用于膜電容監測的鎖相放大器，多種軟件功能集成于一體
展開 |