在現今分子生物領域中，樣本的核酸提取、檢測和定量已是每個實驗室常用的實驗手段。近年，實時定量PCR和第二代測序技術的誕生更令核酸提取的需求大大增加。這些新的核酸檢測技術對核酸的純度要求比較高，所以核酸提取的質量也比以前更受注重。另一方面，準確的核酸定量對于這些新技術，如第二代測序，起了成敗的關鍵作用。因此，現今的核酸提取、檢測和定量技術都跟以往有著重大的改變。
核酸提取 |
以往核酸提取是采用人手配合試劑盒去進行，由于是人手操作，通量較高的時候往往需要很長時間。而且，基于不同實驗人員的經驗和熟練程度有所不同，核酸提取的時間和純度的一致性或許會有分別。面對這些問題，核酸提取的過程開始走向自動化操作以確保提取效果的穩定性。在經典核酸提取和純化方法中，生物磁珠法最好。該技術是將純化介質包被在納米級生物磁珠表面，通過介質對核酸的吸附，在外加磁場下使核酸附著于磁珠定向移動，從而達到固液分離純化的作用。因此，要實現核酸提取自動化，磁珠法是最好的選擇。因為磁珠法的步驟可以完全在移液平臺上進行，而且提取的純度和產量高(每mg磁珠可吸附500μg DNA)，并且可同時進行96個或384個樣本核酸提取。這種方法開始在高通量的實驗室受到重視。市面上有很多磁珠法的核酸提取試劑盒，它們大部份都可以跟移液平臺結合起來。 |
核酸檢測和定量 |
核酸提取以后，下一步就是檢測和定量。對于下游進行第二代測序實驗，這一步非常重要。如果定量不準確，會非常影響測序的結果，導致浪費了高昂的實驗成本。傳統的核酸檢測是采用紫外分光亮度法，通過A260與A280的比值來判定有沒有蛋白質的污染。在TE緩沖液中，純DNA的A260/A280比值為1.8，純RNA的A260/A280比值為2.0。比值升高與降低均表示不純。其中蛋白質與在核酸提取中加入的酚均使比值下降。蛋白質的紫外吸收峰在280nm與酚在270nm的高吸收峰可以鑒別主要是蛋白質的污染還是酚的污染。RNA的污染可致DNA制品的比值高于1.8，故比值為1.8的DNA溶液不一定為純的DNA溶液，可能兼有蛋白質、酚與RNA的污染，需結合其它方法加以鑒定。比較精確的方法有熒光定量PCR法和熒光染色法，如PicoGreen、EB、Oligreen等方法，其中以PicoGreen熒光法最為方便和準確。PicoGreen是比較常見用作核酸定量的熒光染料之一，它能夠結合雙鏈DNA，具有非常好的特異性。PicoGreen跟DNA結合之后可以利用熒光酶標儀進行高通量測定。 |
| 核酸提取和檢測的新趨勢 |
為了解決通量和一致性的問題，核酸提取和檢測需要更高效和準確的平臺。伯齊科技同時引入了美國移液平臺先驅－Apricot Desings公司的高通量全自動移液工作站和德國BMG Labtech多功能酶標儀，并聯合成為自動化核酸提取、檢測和定量平臺。美國Apricot Designs的TPS系列是一個多功能的移液平臺，它不但實現了自動化的移液工作，而且可達到非常好的準確度。在TPS平臺上配合磁珠試劑盒便可進行自動化和高通量的核酸提取，最快可在40分鐘內完成480個樣本的核酸提取和純化。除了核酸提取工作外，TPS系統還可進行多種實驗，如PCR、板對板移液、梯度稀釋、ELISA、等。因此，它非常適合高通量和多元化的研究單位。 |
| TPS-EZ自動核酸提取平臺 裂解：加入200ul樣本、裂解液和蛋白酶K，56度孵育10分鐘 結合：加入100ul磁珠、異丙醇混勻后靜置10分鐘，間歇混勻5次 吸附磁珠：將深孔板移至磁力架上，并吸棄上清 洗滌：分別加入洗滌液W1A、W2洗滌磁珠，去除磁珠上的蛋白和鹽分 洗脫：加入洗脫液Eluent A洗脫核酸，可以直接用于如qPCR等實驗 |
| 核酸提取和純化后利用紫外光吸引進行檢測，找出比純度較好的樣本，再用PicoGreen熒光染色法進行準確定量。這個檢測和定量的過程便會利用到吸收光和熒光檢測，所以需要一臺靈敏度高和穩定性好的多功能酶標儀作為檢測 |
| 工具。德國的BMG Labtech是一家專業的高端酶標儀廠家，它的多功能酶標儀是歐美各大藥廠的必備儀器。其中它的FLUOstar Omega型號具有獨特的超速分光技術和高靈敏度的熒光檢測光路，使其非常適合核酸的定量和檢測。圖1. FLUOstar Omega 220nm-1000nm的全波長檢測 |
| FLUOstar Omega的超速分光計可以以每孔小于1秒的速度把全波長(220nm-1000nm)數據記錄下來(圖1)，也就是一瞬間把 260nm、280nm和所有波長的吸收值檢測出來，并把A260/A280自動計算出來。而高靈敏的熒光檢測光路就可使PicoGreen的檢測結果更準確，由于FLUOstar Omega的熒光靈敏度很好且檢測范圍很寬，從0.39pg到50pg的核酸濃度都有非常好的線性結果(圖2)。圖2. 0.39－50pg/ul dsDNA標準曲線 |
因此，綜合了Apricot Designs的TPS核酸提取儀和 BMG Labtech FLUOstar Omega多功能酶標儀，伯齊科技可以提供一個全面、穩定、準確和自動化的核酸提取、檢測和定量平臺。結合這兩個系統，高通量的核酸提取純化和檢測定量可以很方便簡單地完成。目前為止，很多研究單位和大規模的測序機構都是利用我們這套平臺去解決核酸提取和檢測的問題。這也是高通量分子生物研究的一大趨勢！ |
參考資料： |
http://bmglabtech.customers.condeon.net/media/35216/1044002.pdf |
http://bmglabtech.customers.condeon.net/media/35216/1043726.pdf |
http://bmglabtech.customers.condeon.net/media/35216/1066012.pdf |
http://www.bio-gene.com.cn/MainProducts/Cn/Proshow.asp?ID=967 |