自然殺傷細胞和淋巴因子激活殺傷細胞的殺傷功能實驗

　　
LAK是NK或T細胞在體外高劑量IL-2誘導下，獲得能殺傷NK抵抗的腫瘤細胞的功能，在過繼免疫治療腫瘤中已得到廣泛的應用。

　　
通過將同位素⁵¹Cr摻入到NK的靶細胞K562（紅白細胞白血病細胞）或LAK的靶細胞LiBr（黑色素瘤細胞），按一定細胞比例與效應細胞（NK或LAK）孵育4 小時，根據細胞上清中靶細胞被殺傷后所釋放的⁵¹Cr水平計算出殺傷細胞的殺傷活性。

K562 LiBr

3H-TdR 51Cr FCS RPMI1640 rHu IL-2

培養瓶 培養板 CO2孵箱 液閃儀 計數儀

一、效應細胞的制備

　　
NK功能效應細胞可取靜止的PBMC，或經不同細胞因子誘導的PBMC。

　　
LAK功能的效應細胞通常將PBMC或腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）或體液（癌性胸腹水）中純化的淋巴細胞（1×10⁶ /ml）在含有高劑量IL-2（200～1000 μ/ml）的10 ％FCS RPMI1640 誘導2～5 天而成。

　　
二、殺傷試驗

　　
主要有4 h ⁵¹Cr釋放法和³H-TdR釋放法，前者要求⁵¹Cr質量好，同位素半衰期較短，操作所需時間短；后者需要無菌操作，所需時間較長。

　　
1.  ⁵¹Cr 4 小時釋放試驗

　　　　　　　　　
（1）收獲處于對數生長期的靶細胞（K562，LiBr等）洗滌后調整細胞濃度為2×10⁶ /ml

（2）取1×10⁶細胞（0.5 ml），加Na₂⁵¹CrO4 100 μci，37 ℃孵育2～3 h，每15 min輕輕振搖一次

（3）用10 ％FCS RPMI1640洗滌3 次，每次800 rpm，5 min

（4）重懸細胞濃度1×10⁵ /ml

（5）96 孔V型或U型培養板中，每孔加100 μl（1×10⁴細胞），每份3 個復孔

（6）每孔加入100 μl不同細胞濃度的效應細胞，最大釋放組加入100 μl，1 ％TritonX-100；自然釋放組加100 μl完全培養基

（7）200 g 離心1 min，37 ℃、CO₂孵箱 4 h，200 g 離心1 min

（8）每孔取出100 μl上清，γ計數儀上測定cpm值

　　
（9）計算
 

　　　　　　　　　　實驗組cpm-自然釋放cpm

特異性殺傷率（％）＝─────────────

　　　　　　　　　　最大釋放cpm-自然釋放cpm

　　
2.  ³H-TdR釋放試驗

　　　　　　　　
（1）收獲處于對數生長期的靶細胞（K562、LiBr等）洗滌后調整細胞濃度為2×10⁶ /ml，加³H-TdR 20 μci

（2）37 ℃孵育2～3 h

（3）用10 ％FCS RPMI1640洗滌3 次，每次800 rpm，5 min 調整細胞濃度為1×10⁵ /ml

（4）96 孔U型或平底培養板中，每孔加100 μl（1×10⁴細胞），每份3個復孔

（5）每孔加入100 μl不同細胞濃度的效應細胞，最大釋放組加100 μl 1％TritonX-100，自然釋放組加100 μl完全培養基

（6）CO₂孵箱培養18～24 h

（7）每孔吸出100 μl上清，加入胰蛋白酶（終濃度0.15 ％）和DNA酶（終濃度為0.0125 ％）

（8）繼續孵育30 min

（9）用細胞收集儀收獲于玻璃纖維紙上

（10）干燥后，移入液閃瓶中，加入1 ml閃爍液，β液閃儀中測cpm值

（11）計算
 

　　　　　　　　　　　 實驗組cpm

特異性釋放率（％）＝(1- ────── )×100％

　　　　　　　　　　　 對照組cpm

1.  每次試驗最好取3～4 個不同效應細胞/靶細胞比例，常用效靶比例為100∶1，50∶1，25∶1，12.5∶1。

　　
2.  誘導LAK細胞過程中要注意無菌操作。

　　
3.  避免同位素污染。

　　
4.  根據實驗需要，可采用純化的NK細胞作為效應細胞，用Percoll不連續密度梯度離心純化NK細胞。
 

（1）1個溶解單位（Lytic unit，LU）為一定效應細胞30 ％溶解（殺傷）5×10³靶細胞（K562）的水平。

（2）如需進一步純化LGL，可通過除去具有高親和性羊紅細胞受體細胞（T細胞），因為NK細胞只具有低親和性的綿羊紅細胞受體（ER）。具體方法是將Percoll分離的位于第2梯度的細胞洗滌后調整細胞濃度為5×10⁶ /ml，移入試管，加入2 mlFCS和2 ml 1×10⁸ /ml SRBC，100 g離心5 min，29 ℃孵育1 h，輕輕重懸細胞，疊加于3 ml Ficoll上，400 g室溫下離心30 min界面不形成花環的細胞即為LGL，純度可>90％。

　　
（3）在用PBMC作為效應細胞進行NK活性測定時，如想除去PBMC懸液中混雜的紅細胞，可用蒸餾水低滲的方法除去紅細胞，而不用NH₄Cl方法，因為后者可降低NK功能。

　　
（4）在小鼠NK實驗中必須注意小鼠的品系和周齡，不同小鼠系NK活性有明顯的差別
 

（5）3周以內或超過3個月以上小鼠的NK水平一般很低。