色譜分析技術

高壓液相色譜

Martin 和 Synge在1941年就提出高效相色譜的設想，然而直到六十年代后期，由于各種技術的發展，高效液相色譜才付諸實現。這種色譜技術曾被稱為高速液相色譜（HighSpeed Liquid Chromatography），高壓液相色譜（High Parss-ure Lipuid Chromatography），目前使用最多的名稱是高效液相色譜（High Pe-rformance Liauid Chromatography，HPLC）。高效液相色譜已經廣泛地應用，成為一項不可缺少的技術。它的主要優點是⑴分辯率高于其它色譜法；⑵速度快，十幾分鐘到幾十分鐘可完成；⑶重復性高；⑷高效相色譜柱可反復使用；⑸自動化操作，分析精，確度高。根據分離過程中溶質分子與固定相相互作用的差別，高效液相色譜可分為四個基本類型，即液－固色譜、液－液色譜、離子交換色譜和體積排阻色譜。高效液相色譜在生物領域中廣泛用于下列產物的分離和鑒定：⑴氨基酸及其衍生物；⑵有機酸；⑶甾體化合物；⑷生物鹼；⑸抗菌素；⑹糖類；⑺卟啉；⑻核酸及其降解產物；⑼蛋白質、酶和多肽；⑽脂類等。

一、分類

高效液相色譜法可分為四個基本類型：即液－固色譜法，鍵合相色譜法，離子交換色譜法及體積排阻色譜法。

（一）液－固色譜法

液－固色譜法通常稱吸附色譜法，吸附劑有活性碳，氧化鋁和硅膠，在液－固色譜法中用的載體都是硅膠。硅膠對溶質，分子的吸附能力不是平均分布在整個硅脫表面的，在硅膠表面有一些區域與溶質分子強烈相互作用，這些區域為活性位置，硅膠與溶質分子間主要作用是偶極距力氫鍵及靜電相互作用。極性越強，而化合物在硅膠柱上的滯留時間也長。在液－固色譜中，依靠流動相溶劑分子與溶質分子競爭固定相互活性位置， 從而使溶質從色譜柱上洗脫下來。與硅膠表面活性位置結合力強的溶劑洗脫溶質分子的能力強，因而稱強溶劑，反之為弱溶劑。液─固色譜法的特點是適于分離色譜幾何異構體，可用于脂溶性化合物質如磷脂，甾體化合物，脂溶性維生素，前列腺素等。

（二）鍵合相色譜法

鍵合相色譜法是由液－液色譜法即分配色譜發展起來的。鍵合相色譜法將固定相共價結合在載體顆粒上，克服了分配色譜中由于固定相在流動中有微量溶解，及流動相通過色譜柱時的機械沖擊，固定相不斷損失，色譜柱的性質逐漸改變等缺點。鍵合相色譜法可分為正常相色譜法和反相色譜法。

1. 正常相色譜法

在正常相色譜法中共價結合到載體上的基團都是極性基團，如一級氨基、氰基、二醇基、二甲氨基和二氨基等。流動相溶劑是與吸附色譜中的流動相很相似的非極性溶劑，如庚烷、已烷及異辛烷等。由于固定相是極性，因此流動溶劑的極性越強，洗脫能力也越強，即極性大的溶劑是強溶劑。固定相與流動相的這種關系正好與液－固色譜法相同，稱這種色譜法為正常相色譜法。盡管如此，正常相色譜法的分離原理主要根據化合物在固定相及流動相中分配系數的不同進行分離，它不適于分離幾何異構體。