熒光定量PCR——qPCR的原理及應用

　　qPCR的英文全名是Real-timeQuantitative PCR Detecting System。即實時熒光定量核酸擴增檢測系統，也叫實時定量基因擴增熒光檢測系統，簡稱qPCR。

　　上世紀八十年代Cetus Corporation公司的化學家Kary Mullis發明了PCR，如今DNA擴增技術儼然已經成為了生物學研究的基礎。三十多年以來，人們為了解決研究中出現的新問題新需求，不斷對這一經典技術進行改良。從經典PCR、實時定量PCR再到現在的數字PCR，PCR技術在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。如今PCR技術早已走出實驗室，在遺傳學鑒定和疾病診斷中發揮著巨大的作用，在越來越廣闊的領域里煥發著新的活力。

　　終點PCR是最原始、最簡單的PCR方法，如今仍在被我們廣泛使用。使用者只能在PCR反應結束之后，通過凝膠電泳、毛細管電泳等方法對產物進行檢測。終點PCR本身是無法定量的，因為該反應產出的DNA量不一定能反映最初情況。舉例來說，不同樣品和序列的擴增效率是有差異的。

　　PCR的反應過程：

　　傳統PCR電泳結果：

（圖片來源于網絡）

　　因此，研究者們克服了PCR定量分析的挑戰——實時定量PCR（qPCR）。qPCR主要是利用插入性染料或熒光探針（比如TaqMan），人們可以通過監控PCR過程中的熒光強度比較多個樣品的DNA水平。

　　在qPCR中使用插入性DNA染料，隨著PCR循環的連續進行，這種染料的熒光強度會不斷增強，從而可以使人們對反應中的DNA進行定量。利用熒光信號的變化，實時監測PCR擴增反應中的每一個循環擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。

qPCR的特點

　　·靈敏度高

　　·特異性強

　　·全封閉PCR過程，無需后續處理

　　·及時反饋擴增過程，摒棄重點數據，更適用于定量

　　·定量范圍寬，可達10個數量級，無需稀釋樣品

　　·可實現一管多檢

　　·儀器自動分析，更快獲得結果

　　qPCR的原理

　　·什么是Ct值？

　　PCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數。

　　·Ct值的重現性

　　Ct值的特點：相同模板進行96次擴增，終點處產物量不恒定；Ct值則極具重現性。

　　簡單來說，模板DNA量越多，熒光達到閾值的循環次數越少，即Ct值越小；Log濃度與循環數呈線性關系，通過已知拷貝數的標準品可做出標準曲線，根據樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量。

　　qPCR定量分析，有絕對定量和相對定量兩種。

　　·絕對定量：精確計算初始反應的模板濃度（DNA/RNA）

　　——病毒DNA或RNA的拷貝數

　　——轉基因的拷貝數

　　·相對定量：計算初始反應模板的相對含量

　　——差異表達分析

　　——芯片評估

　　——轉基因生物的檢測

　　——基因型檢測

　　qPCR常用的熒光標記

　　·非特異性熒光標記

　　——SYBR Green I

　　——EvaGreen

　　——LC Green

　　·特異性熒光標記

　　——TaqMan

　　——Molecular Beacon

　　——Amplisensor

　　qPCR的應用

　　·基因擴增

　　·擴增特異性分析

　　·基因定量分析

　　·基因檢測

　　·基因分型

　　·SNP分析

　　·RFLP多態性分析

　　·單/多基因表達研究

　　·高通量基因表達譜研究

　　目前qPCR技術廣泛應用于生物醫藥食品等行業，運用于疾病的早期診斷、遺傳病的早期診斷、藥物研究、腫瘤的診斷與研究、食品病原微生物的檢測、轉基因食品檢測、動物疫病檢測等。