(1)反應的循環數不夠：一般要在35個循環以上，但是過多的循環次數可增加背景值。
(2)檢測熒光信號的步驟有誤：SYB-Rgreen法（SG法）采用的是72延伸時采集熒光信號，Taman法則是在退火結束或延伸結束時進行信號采集。
(3)引物或探針降解: 可通過PAGE電泳檢測其完整性，若是電泳條帶呈彌散狀，可考慮重新合成引物或探針。
(4)模板量不足: 對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
(5)模板降解: 避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。
(6)序列或者引物有誤：檢測樣品中不含有待檢測基因。