近幾年，從科學研究到臨床檢測，從“非洲豬瘟”檢測到“新冠病毒”檢測，熒光定量PCR儀器已成為分子生物學研究的常規設備。檢測方法的迅速發展，檢測任務的緊急也對檢測人員提出了更高的要求，需要他們具備熟練判斷數據結果的能力。對于熒光定量PCR的結果的判斷，最直觀的判斷就是看擴增曲線是否正常。很多老師在平時實驗中會遇到異常擴增曲線的困擾，比如打折的擴增曲線、復孔間重復性不好、陰性樣本擴增曲線抬升等。面對異常的擴增曲線，大家也不用擔心，接下來我們會結合幾個實例，帶著大家一起來看一下比較常見的異常擴增曲線的分析攻略。
1
確認軟件設置是否正確
對照試劑盒說明書，檢查時間、溫度、循環數、熒光采集等是否設置正確。有一個比較容易忽略的設置問題是，需要看下所選用的試劑中是否含有ROX來作為參比熒光染料。Applied BiosystemsTM系列熒光定量PCR
儀器可以用ROX來作為參比熒光染料，用以校正儀器系統以外的物理誤差，比如均一化校正由于移液誤差或者蒸發導至的批內體積誤差等。目前市面上有的的熒光定量PCR預混液是不含有ROX的，當用此類試劑的時候，應該將ROX參比功能關閉，否則可能會出現圖一左圖所示的，擴增曲線異常的現象。遇到這種問題，可以在Plate
Setup設置中找到Passive Reference，把ROX改為None，重新分析一下，結果就變正常了（圖一右圖）。Applied
BiosystemsTM系列熒光定量PCR 儀器默認是對所有熒光通道及所有樣品孔進行熒光采集，用戶不用擔心數據丟失，實驗完成后，還可以對設置錯誤的反應孔的熒光通道、樣品名稱等進行更改。 圖一：使用不含ROX試劑，忘記更改Passive Reference結果圖及更改后的結果圖 還有一些結果，多組分圖擴增曲線沒有抬升，是很明顯的陰性樣本，但是擴增圖譜的擴增曲線抬升了，這樣就會與閾值線相交，反而有了CT值。這是由于軟件在進行基線自動扣除的時候出現錯誤，引起了擴增曲線抬升（圖二）。出現這種情況可以采取手動調整基線的方法，重新定義基線即可正常，即將基線起點改為熒光信號穩定的循環數（一般是3），基線終點要改成擴增曲線起峰的前一個循環數（比如起峰是在第25個循環，那基線的終點就是24）。引起這樣的原因是由于選用的耗材、試劑或者操作的原因導至背景熒光信號有所波動，從而造成反應孔的自動基線扣除錯誤。 圖二：基線自動扣除錯誤，導至擴增曲線抬升 2 確定耗材及儀器配件是否使用正確 耗材對于熒光定量PCR來說比較重要，很多異常的擴增曲線是由于耗材使用不當引起的。常見的耗材相關問題包括： 1）錯誤使用成普通PCR儀器所對應的耗材 普通PCR耗材一般透光度比較差，會造成熒光擴增曲線異常，比如打折的擴增曲線（圖三）； 圖三：錯誤使用普通PCR耗材的結果 目前Applied BiosystemsTM系列熒光定量PCR
儀加熱模塊分0.2ml跟0.1ml兩種，實驗前一定要確定自己的儀器是哪一種加熱模塊，再來選擇對應的耗材。如果0.1ml加熱模塊用成0.2ml耗材，則會造成耗材壓扁，甚至造成機器故障；如果0.2ml加熱模塊用成0.1ml耗材，則會造成反應管的外壁和熒光定量PCR儀器的溫控模塊沒有充分接觸，從而出現熱傳導不充分，進而影響酶的活性，會引起重復性不好（圖四），或者溶解曲線多峰（非特異擴增），甚至是假陰性結果； 圖四：耗材規格跟加熱模塊不匹配造成重復孔間差異 Applied BiosystemsTM系列的熒光定量PCR儀器是一個開放的平臺，客戶可以使用開放的試劑、開放的耗材。但是目前市面上熒光定量PCR耗材種類繁多，質量也是良莠不齊，在耗材選擇上盡量選擇質量、品牌好一點的，切莫因為便宜選用質量很差或不符合要求的耗材，否則會引起一系列問題，引來實驗的困擾，造成不必要的時間、精力和試劑、樣本的浪費。比如質量不好的耗材可能會引起熒光值不穩定，這會造成反應孔的自動基線扣除錯誤，得到不準確的CT值（圖五左圖），更換質量好的耗材后，熒光信號正常（圖五右圖）； 圖五：質量不好的耗材引起熒光值不穩定圖及更換Applied BiosystemsTM耗材后結果 如果使用的PCR反應板封膜質量不好，在PCR過程中受到水蒸氣的影響，容易產生變形（圖六），這樣會引起“optical
warping”，即“光學扭曲”現象（圖七
左圖），該實驗中由于使用了ROX作為參比染料，ROX有效的校正了這種熒光信號的變化，均一化的擴增圖結果是正常的（圖七 右圖）。 圖六：PCR過程中水蒸氣使得封膜變形 圖七：光學扭曲結果圖及ROX均一化結果圖 除了耗材外，跟儀器配套使用的配件也要檢查是否使用正確，比如QuantStudio 5配套的8聯管托架，在使用的時候只用托架的下半部分，如果忘記把上半部分取下，有可能會影響擴增（圖八），具體Applied BiosystemsTM系列的熒光定量PCR儀器配件對應使用情況，可參考之前的文章《貼士：正確使用熒光定量儀器配件和耗材（更新版）》。 圖八：未將托架上半部分取下，造成有些靶標未擴增 3 確定所用試劑是否正常 如果設置都正確，耗材及配件也都沒問題，但是擴增曲線還是異常，這時候要確定下所用試劑是否正常。首先要確定試劑是否有效，包括查看試劑是否在有效期內，是否反復凍融多次，運輸條件是否正常。可以通過比較試劑的批次號，結合實驗中的陽性對照結果，確定試劑的有效性。其次要觀察擴增完的試劑體積，如果在擴增過程中有試劑的蒸發，可能會引起擴增曲線抬升現象，如果實驗體系中加入了ROX作為參比熒光，ROX熒光可以區分擴增曲線抬升是真擴增，還是蒸發。比如反應體系存在蒸發，水分丟失，ROX濃度會增加，ROX參比熒光上抬（圖九左圖），而正常孔中ROX熒光會一直不變（圖九右圖），所以在加完試劑上機前，一定要檢查耗材是否已經密封，防止試劑蒸發，試劑蒸發嚴重的還可能導至整個實驗室的氣溶膠污染。 圖九：試劑蒸發引起擴增曲線抬升 4 確定實驗過程中的操作細節 如果以上都正常，還要確定下實驗過程中的操作細節。比如在做標準曲線的時候是否是梯度稀釋的標準品，如果不是梯度稀釋標準品，可能會引起標準曲線擴增效率或者R2值異常；從冰箱冷凍中取出的試劑是否有混勻，如果試劑融化后沒有混勻，這時候取出的試劑不是均一的，會影響后面的擴增；定量PCR預混液跟核酸模板加好后是否混勻，如果沒有混勻，特別是樣本體積比較大的時候（超過PCR體系的20%），更容易發生optical
mixing現象。因為樣本是水相會在上層，試劑（含有甘油成分）會在下層，在前期的PCR過程中不足以混勻完全，這樣會形成折射，熒光較強，而一般加熱幾個循環后樣本跟預混液會混勻，熒光就變穩定了（圖十）。 圖十：樣本跟預混液未混勻現象 還有上機的反應體系里盡量不要有大的氣泡，有氣泡的話，中間容易形成折射，干擾熒光的采集（圖十一）。所以實時熒光定量PCR實驗的細節還是要特別注意的。 圖十一：反應體系中有氣泡 以上是我們在面對常見的一些異常擴增曲線的分析思路，希望能夠幫助各位老師處理擴增曲線異常的問題。除了我們提到的幾種情況之外，在平時實驗過程中我們可能還會遇到“千姿百態”的異常擴增曲線，大家可以利用上面介紹的思路加以分析，有些我們可能需要具體問題具體分析，也歡迎大家跟賽默飛的技術支持團隊進行溝通和交流。
2）未選擇跟儀器加熱模塊規格匹配的耗材
3）使用了質量比較差的耗材
