實時熒光定量PCR是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。
實時熒光定量PCR是實驗室最常用的實驗。研究基因在mRNA表達水平,以及驗證基因敲除后下游靶基因變化情況等等。對于新手來說，如何利用primer3plus快速設計引物呢？
首先，推薦三個在線設計實時熒光定量PCR引物的網站，不用安裝軟件，直接上網就可搞定。
一、Primerbank
1. 首先進入網站主頁，https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/。選擇Keyword,根據自己需求選擇種屬以及基因名稱。比如設計人類BCL2基因。
2.點擊submit后可以看到以下界面，網站會推薦多對引物，可以根據引物長度、Tm值選擇。
二、Pubmed
1. 在Pubmed網站找到BCL2基因組序列，點擊FASTA獲得基因序列后，將基因序列下載到桌面上。
2．點開pubmed主頁上面的Blast,進入Primer-BLAST, 輸入基因序列，可以根據自己實驗要求選擇引物長度。
3．點擊Get primer之后，可以得到多對引物序列。可以根據引物長度等要求進行篩選。
三、Primerplus3
1.在Pubmed-gene獲得基因序列后，在primer3plus主頁上輸入基因序列，網址; http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi。
2.點擊general setting,設置引物擴增長度，一般可設置擴增長度偏大一些，然后根據推薦引物選取合適擴增長度。
3. 點擊pick primers后，首先會看到優選推薦的一對引物，同時在序列中看到引物所在位置。Primer3plus網站中可以看到引物Tm值以及GC含量。
（1）引物長度一般在15——30堿基之間，過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進行反應。
（2）引物GC含量在40%——60%之間，Tm值最好接近72℃。引物的Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，一般計算公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值。
（3）引物應具有特異性。引物設計完成以后，應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。
（4）引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾結構使引物本身復性。
（5）引物擴增長度：一般RT-PCR引物擴增長度在100-200bp。
實時熒光定量PCR是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。
實時熒光定量PCR是實驗室最常用的實驗。研究基因在mRNA表達水平,以及驗證基因敲除后下游靶基因變化情況等等。對于新手來說，如何利用primer3plus快速設計引物呢？
首先，推薦三個在線設計實時熒光定量PCR引物的網站，不用安裝軟件，直接上網就可搞定。
一、Primerbank
1. 首先進入網站主頁，https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/。選擇Keyword,根據自己需求選擇種屬以及基因名稱。比如設計人類BCL2基因。
2.點擊submit后可以看到以下界面，網站會推薦多對引物，可以根據引物長度、Tm值選擇。
二、Pubmed
1. 在Pubmed網站找到BCL2基因組序列，點擊FASTA獲得基因序列后，將基因序列下載到桌面上。
2．點開pubmed主頁上面的Blast,進入Primer-BLAST, 輸入基因序列，可以根據自己實驗要求選擇引物長度。
3．點擊Get primer之后，可以得到多對引物序列。可以根據引物長度等要求進行篩選。
三、Primerplus3
1.在Pubmed-gene獲得基因序列后，在primer3plus主頁上輸入基因序列，網址; http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi。
2.點擊general setting,設置引物擴增長度，一般可設置擴增長度偏大一些，然后根據推薦引物選取合適擴增長度。
3. 點擊pick primers后，首先會看到優選推薦的一對引物，同時在序列中看到引物所在位置。Primer3plus網站中可以看到引物Tm值以及GC含量。
（1）引物長度一般在15——30堿基之間，過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進行反應。
（2）引物GC含量在40%——60%之間，Tm值最好接近72℃。引物的Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，一般計算公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值。
（3）引物應具有特異性。引物設計完成以后，應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。
（4）引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾結構使引物本身復性。
（5）引物擴增長度：一般RT-PCR引物擴增長度在100-200bp。