熒光定量PCR技術原理及利用

熒光定量PCR技術是在PCR技術的基礎上發展而來的，PCR技術是由人創造的模擬基因組DNA自然條件下的復制的一項技術。我們都知道，基因組要完成復制才能發生細胞的分裂；如果基因組不能復制，那么隨著細胞的分裂，基因組會被逐漸稀釋。正是由于基因組的半保留復制，才使得物種的繁衍得到生生不息。正如上所述，基因組的復制是以半保留復制的方式進行的；在復制時DNA雙螺旋鏈解旋，裸露出需要互補配對的堿基，這個時候細胞內的dNTPs、DNA
polymerase等成分紛紛進入功能空間，隨著時間的推移一條與原來模板鏈互補配對的新鏈產生了。人們在闡釋了基因組的復制以后，開啟了創造性模擬這一自然發生的生化反應的探索實踐，并最終于1985年由美國的K.B.Mullis成功發明，Mullis還因此獲得了1993年的諾貝爾化學獎。（試吧商城【shibamarket】）
簡單來說，PCR技術就是將引物（可以與DNA單鏈模板互補配對的一小段DNA寡核苷酸鏈）、模板、dNTPs、DNA
ploymerase、反應Buffer、ddH2O等配制成一個反應體系，然后按照反應所需要的溫度順序進行溫控式執行反應；經過數十個循環以后，產生不計其數的與原始模板序列幾乎一樣或互補配對的新生序列，這樣就得到了大量的用于后續實驗的DNA模板。（試吧商城【shibamarket】）
熒光PCR技術是在PCR技術日趨完善的基礎上，為了能實時監測PCR反應過程中的所需DNA片段含量的發展變化，科研工作者又對DNA與熒光小分子的相互作用進行了深入研究并取得大量積極的成果；而后將兩項技術結合起來，并融合了快速發展的計算機軟件技術，形成了這種可以既能精確地控制PCR反應所需的溫度變化要求，又能實時地收集反應體系受到激發光照射后產生的熒光信號，還能將這種熒光信號轉變為計算機軟件可接受并處理的電子信息；并最終誕生了實驗人員通過計算機軟件就可以控制和檢測普通PCR體系的Real
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qPCR技術。Real
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PCR體系與一般PCR體系在成分組成上多出了小分子熒光染料或熒光探針這一成分。在溫度控制方面多出了DNA熔解這一程序，就是通過梯度式地變化溫度，使DNA雙螺旋逐步分離開來；因為熒光染料只有嵌合在DNA雙螺旋上才能被激發產生熒光，所以通過檢測熒光信號的變化峰值就可以推斷出引物的特異性如何，換句話說就是可以分析所擴增的DNA雙螺旋有幾種序列組成。（試吧商城【shibamarket】）
通過此技術，可以使實驗人員利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法；并利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。Real-Time
qPCR技術即實時熒光定量PCR技術避免了傳統PCR以終產物監測定量產生的偏差，提高實驗的重復性。當然，反轉錄酶的發現和利用使Real
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PCR技術的適用范圍由現成DNA為模板擴大到間接地以RNA為模板。該技術目前已被廣泛應用于監測處理后細胞mRNA表達量的變化、比較不同組織的mRNA表達差異、驗證基因芯片、驗證引物特異性、檢測siRNA干擾的實驗結果、檢測非翻譯RNA的表達變化、檢測細胞富集度、驗證表觀遺傳學的影響等等。